細胞質分裂におけるアクチン繊維と膜蛋白質(CD43とCD44)との相互作用の解析

胞质分裂过程中肌动蛋白纤维与膜蛋白（CD43和CD44）相互作用的分析

• 批准号: 07780637
• 负责人: 米村 重信
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780637/
• 关键词: 分裂溝; ERM; CD43; CD44; アクチン繊維

1、分裂溝においてアクチン繊維が細胞膜を引っぱるための構造的基盤にERM蛋白質が含まれるのではないかと考え、ERM蛋白質と分裂溝に濃縮するタイプの膜蛋白質とが実際に結合するのかを検証することにした。2、ERM蛋白質は、バキュロウイルス/昆虫細胞の発現系から精製したものを使用した。膜蛋白質としては、CD43とCD44とを選び、GST融合蛋白質のかたちで、その細胞質領域を大腸菌に発現させ、グルタチオンビーズ上に精製した。ビーズ上の融合蛋白質とERM蛋白質を混合し、洗浄後も結合しているERM蛋白質を抗体により検出した。細胞における局在を見るためには、E型カドヘリンの細胞外領域をダクとCD43:CD44の細胞質領域の全長や欠損変異蛋白質をつなげた融合蛋白質を哺乳類培養細胞に発現させた。3、CD43とCD44の細胞質領域とERM蛋白質とは、in vitroにおいて直接結合した。この結果は、それぞれの膜蛋白質の細胞における分布がERM蛋白質と一致することを分子レベルで示すものであり、ERM蛋白質がアクチン繊維と細胞膜との結合の場に含まれることを支持する。膜蛋白質における、ERMとの結合に必要な領域を細胞膜直下の約30アミノ酸(CD43)、訳20アミノ酸(CD44)にまで絞り込むことができた。細胞の中でERMとCD43、CD44との分布が一致することに、これらの結合領域が実際に必要かどうかを確かめるために、CD43、CD44の細胞質領域の欠損変異膜蛋白質をマウスL細胞に発現させたところ、結合領域を持つ膜蛋白質はERMと局在が等しく、結合領域を持たない膜蛋白質は局在の正確な一致は見られなかった。これらの2つの結合領域のアミノ酸配列間共通点である、正の荷電が結合に必要なのかもしれない。

1。我们认为，ERM蛋白可能包含在肌动蛋白纤维在裂变凹槽中拉出细胞膜的结构基础，并决定研究浓缩裂变凹槽中浓缩凹槽中的ERM蛋白和膜蛋白是否真的相互结合。 2。从杆状病毒/昆虫细胞表达系统中纯化ERM蛋白。选择CD43和CD44作为膜蛋白，并以GST融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达胞质区域，并在谷胱甘肽珠上纯化。混合珠子上的融合蛋白和ERM蛋白，并在洗涤后通过抗体检测到结合的ERM蛋白。为了看到细胞中的定位，在培养的哺乳动物细胞中表达融合蛋白，该细胞是E型钙粘着型的细胞外区域，它连接了DAC和CD43：CD44的细胞质区域的全长以及有缺陷的突变蛋白。 3。CD43和CD44和ERM蛋白的细胞质区域在体外直接结合。该结果表明，每个膜蛋白在细胞中的分布与ERM蛋白一致，支持ERM蛋白包括在肌动蛋白纤维和细胞膜之间的结合位点中。将膜蛋白中与ERM结合所需的区域缩小到直接在细胞膜下方的大约30个氨基酸（CD43）和20个氨基酸（CD44）。为了确认由于ERM，CD43和CD44的匹配分布，这些结合区是否实际上是必要的，在CD43的细胞质区域中有缺陷的CD44中的突变膜蛋白，在小鼠L细胞中表达。当具有结合区域的膜蛋白与ERM相等的局部定位时，没有结合区域的膜蛋白不准确地匹配定位。正电荷是这两个结合区域的氨基酸序列之间的共同点，可能需要进行结合。

项目成果

Sagara, J.: "Cellular actin-binding ezrin-radixin-moesin (ERM) family proteins are incorporated into the rabies virion and closely associated with viral envelope proteins in the cell." Virology. 206. 485-494 (1995)

Sagara, J.：“细胞肌动蛋白结合埃兹蛋白-根蛋白-模蛋白 (ERM) 家族蛋白被整合到狂犬病病毒粒子中，并与细胞中的病毒包膜蛋白密切相关。”

Takeda, H.: "V-src kinase shifts the cadherin-based cell adhesion from the strong to the weak state and β catenin is not reguired for the shift." J. Cell Biol.131. 1839-1847 (1995)

Takeda, H.：“V-src 激酶将基于钙粘蛋白的细胞粘附从强状态转变为弱状态，而这种转变不需要 β 连环蛋白。”J. Cell Biol.131（1995）。