細胞質分裂におけるアクチン繊維と膜蛋白質(CD43とCD44)との相互作用の解析

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1、分裂溝においてアクチン繊維が細胞膜を引っぱるための構造的基盤にERM蛋白質が含まれるのではないかと考え、ERM蛋白質と分裂溝に濃縮するタイプの膜蛋白質とが実際に結合するのかを検証することにした。2、ERM蛋白質は、バキュロウイルス/昆虫細胞の発現系から精製したものを使用した。膜蛋白質としては、CD43とCD44とを選び、GST融合蛋白質のかたちで、その細胞質領域を大腸菌に発現させ、グルタチオンビーズ上に精製した。ビーズ上の融合蛋白質とERM蛋白質を混合し、洗浄後も結合しているERM蛋白質を抗体により検出した。細胞における局在を見るためには、E型カドヘリンの細胞外領域をダクとCD43:CD44の細胞質領域の全長や欠損変異蛋白質をつなげた融合蛋白質を哺乳類培養細胞に発現させた。3、CD43とCD44の細胞質領域とERM蛋白質とは、in vitroにおいて直接結合した。この結果は、それぞれの膜蛋白質の細胞における分布がERM蛋白質と一致することを分子レベルで示すものであり、ERM蛋白質がアクチン繊維と細胞膜との結合の場に含まれることを支持する。膜蛋白質における、ERMとの結合に必要な領域を細胞膜直下の約30アミノ酸(CD43)、訳20アミノ酸(CD44)にまで絞り込むことができた。細胞の中でERMとCD43、CD44との分布が一致することに、これらの結合領域が実際に必要かどうかを確かめるために、CD43、CD44の細胞質領域の欠損変異膜蛋白質をマウスL細胞に発現させたところ、結合領域を持つ膜蛋白質はERMと局在が等しく、結合領域を持たない膜蛋白質は局在の正確な一致は見られなかった。これらの2つの結合領域のアミノ酸配列間共通点である、正の荷電が結合に必要なのかもしれない。