イヌジステンパーウイルスの病原性解析と遺伝子治療への応用

昨年に確立したイヌジステンパーウイルス（CDV）のリバースジェネティクス系を応用させ、ウイルスベクターとして細胞への遺伝子導入を試みた。始めに、CDVのウイルスゲノム内全ORFの欠損体作製を試みた。T7プロモーター、ハンマーヘッド型リボザイム、D型肝炎ウイルスリボザイムおよびT7ターミネーターを含むプラスミドベクターにCDVの5'UTRと3'UTR間にEGFP発現遺伝子をクローニングした。得られたプラスミドをCAGプロモーターによる全CDV蛋白発現プラスミドと共にBHK/T7-9細胞へトランスフェクションし、培養上清を回収した。その後、培養上清をA72/cSLAM細胞へと接種し、EGFP蛋白の蛍光を観察した。結果、EGFPのシグナルは得られなかった。パラミクソウイルス科は各ORFの上流UTRにあるgene start(GS)、下流UTRにあるgene end(GE)と呼ばれるシグナル配列を認識してウイルスポリメラーゼが転写を開始、終止することが知られている。本実験ではGSはCDV N遺伝子のものであり、GEはCDV L遺伝子のものであったため、転写が行われなかったと考えられた。そこで、GEの配列をN遺伝子のものに置換したプラスミドを作製し、同様の実験を行ったが、EGFPのシグナルは得られなかった。GS、GEの配列の組み合わせやCDVのパッケージングシグナル配列の欠如が原因と考えられた。次にH遺伝子欠損CDVの作製を試みた。H遺伝子をEGFP遺伝子に置換したCDVゲノムを感染性粒子作製と同様の手法に加え、H蛋白を過剰発現させ実施したが、EGFPのシグナルは得られなかった。しかしながら、上清を用いたウエスタンブロットによる抗原検出ではF蛋白が検出されたため、EGFP遺伝子が発現していないことが考えられた。上述のGS、GEやコドンの最適化などが改善点として挙げられる。

昨年に確立したイヌジステンパーウイルス（CDV）のリバースジェネティクス系を応用させ、ウイルスベクターとして細胞への遺伝子導入を試みた。始めに、CDVのウイルスゲノム内全ORFの欠損体作製を試みた。T7プロモーター、ハンマーヘッド型リボザイム、D型肝炎ウイルスリボザイムおよびT7ターミネーターを含むプラスミドベクターにCDVの5'UTRと3'UTR間にEGFP発現遺伝子をクローニングした。得られたプラスミドをCAGプロモーターによる全CDV蛋白発現プラスミドと共にBHK/T7-9細胞へトランスフェクションし、培養上清を回収した。その後、培養上清をA72/cSLAM細胞へと接種し、EGFP蛋白の蛍光を観察した。結果、EGFPのシグナルは得られなかった。パラミクソウイルス科は各ORFの上流UTRにあるgene start(GS)、下流UTRにあるgene end(GE)と呼ばれるシグナル配列を認識してウイルスポリメラーゼが転写を開始、終止することが知られている。本実験ではGSはCDV N遺伝子のものであり、GEはCDV L遺伝子のものであったため、転写が行われなかったと考えられた。そこで、GEの配列をN遺伝子のものに置換したプラスミドを作製し、同様の実験を行ったが、EGFPのシグナルは得られなかった。GS、GEの配列の組み合わせやCDVのパッケージングシグナル配列の欠如が原因と考えられた。次にH遺伝子欠損CDVの作製を試みた。H遺伝子をEGFP遺伝子に置換したCDVゲノムを感染性粒子作製と同様の手法に加え、H蛋白を過剰発現させ実施したが、EGFPのシグナルは得られなかった。しかしながら、上清を用いたウエスタンブロットによる抗原検出ではF蛋白が検出されたため、EGFP遺伝子が発現していないことが考えられた。上述のGS、GEやコドンの最適化などが改善点として挙げられる。