家禽の換羽を支配するホルモン機構に対する分子生物学的アプローチ

本研究は、家禽の換羽を制御するホルモン機構について、実用的な測定方法がないためにこれまで全く解明されていなかった甲状腺刺激ホルモン(TSH)の関与に関して重点的に検討し、併せて他のホルモンとの相互作用についても明らかにしようとするものであり、研究手法としては主に生化学的手法を用いることとした。昨年度までに、RT-PCR法によるTSHβサブユニットmRNAの定量法を確立し、強制換羽を行ったニワトリの下垂体におけるTSHβサブユニットmRNA、およびステロイドホルモンや下垂体ホルモンの定量を行って、それぞれ興味深い結果を得た。また、TSHβサブユニットに対する抗ペプチド抗体の作成を行い、免疫組織化学およびイムノブロッティングの実験系を確立した。今年度は換羽を行ったニワトリのTSHをより簡便に定量するために、イムノアッセイ系の開発を検討し、時間分解蛍光イムノアッセイを用いたサンドイッチ法による特異的定量法を確立した。この方法はβサブユニットに対する抗体をプレートに固相化し、αサブユニットに対する抗体を蛍光標識して、TSHのそれぞれのサブユニットに結合させて定量するものである。この系は予想したより感度が悪く、血液中のTSHの定量には向かないことがわかったが、下垂体中のTSH量を測る目的には十分であった。さらに高感度なイムノアッセイ系を確立する目的で、COS細胞に遺伝子を導入してTSHαおよびβサブユニットの共発現を行った。この結果、TSHタンパク質が発現したが、細胞内にとどまって培地に分泌されなかった。このため、分泌を行うためのシグナル配列を検討するなどして、組換え体TSHの大量発現と、これを用いた抗体の作成を目指した検討を行った。

本研究は、家禽の換羽を制御するホルモン機構について、実用的な測定方法がないためにこれまで全く解明されていなかった甲状腺刺激ホルモン(TSH)の関与に関して重点的に検討し、併せて他のホルモンとの相互作用についても明らかにしようとするものであり、研究手法としては主に生化学的手法を用いることとした。昨年度までに、RT-PCR法によるTSHβサブユニットmRNAの定量法を確立し、強制換羽を行ったニワトリの下垂体におけるTSHβサブユニットmRNA、およびステロイドホルモンや下垂体ホルモンの定量を行って、それぞれ興味深い結果を得た。また、TSHβサブユニットに対する抗ペプチド抗体の作成を行い、免疫組織化学およびイムノブロッティングの実験系を確立した。今年度は換羽を行ったニワトリのTSHをより簡便に定量するために、イムノアッセイ系の開発を検討し、時間分解蛍光イムノアッセイを用いたサンドイッチ法による特異的定量法を確立した。この方法はβサブユニットに対する抗体をプレートに固相化し、αサブユニットに対する抗体を蛍光標識して、TSHのそれぞれのサブユニットに結合させて定量するものである。この系は予想したより感度が悪く、血液中のTSHの定量には向かないことがわかったが、下垂体中のTSH量を測る目的には十分であった。さらに高感度なイムノアッセイ系を確立する目的で、COS細胞に遺伝子を導入してTSHαおよびβサブユニットの共発現を行った。この結果、TSHタンパク質が発現したが、細胞内にとどまって培地に分泌されなかった。このため、分泌を行うためのシグナル配列を検討するなどして、組換え体TSHの大量発現と、これを用いた抗体の作成を目指した検討を行った。