PCR法を用いたスポロトリコーシスのDNA診断法の確立

皮膚の深在性真菌症であるスポロトリコーシスの、PCR法による実用的なDNA診断法を確立するため、より適切なプライマーの設定を行ない、関連操作の改善を試みた。まず、スポロトリコーシスの原因菌であるSporothrix schenckiiは、ミトコンドリアDNAの制限酵素解析によって少なくとも10数種類以上の遺伝子多型を有することが知られている。そこで、ATCC No.14284の菌株からDNA断片を分離し、複数の菌株で配列を比較し、多数の株に共通で、他の生物とは類似しない遺伝子にプライマーの設定を試みた。その結果、予備的に設定したプライマーでは30菌株中14株(46.7%)菌株でDNAの増幅がみられたのに対し、複数の菌株の塩基配列を考慮して作製したプライマーは、75菌株中69株(92%)でDNAの増幅が確認された。そして、その後さら多くの塩基配列を検討した。次に、実用上の感度向上のため、微量かつ強固な真菌から確実にDNAを抽出する方法を検討した。まず、Zymolyaseやlyticase等の複数の酵素について、スライドカルチャー上の菌体への作用を観察した結果、酵素処理だけでは細胞壁の十分な破壊は困難であると結論した。そして、物理的な破砕と酵素処理を組み合わせ、固い皮膚組織中の、極めて微量の胞子型の菌体から確実にDNAを抽出する方法が必要と考えられた。以上の結果を統合することで、より実用的なスポロトリコーシスのDNA診断法が可能であると考えられた。

皮膚の深在性真菌症であるスポロトリコーシスの、PCR法による実用的なDNA診断法を確立するため、より適切なプライマーの設定を行ない、関連操作の改善を試みた。まず、スポロトリコーシスの原因菌であるSporothrix schenckiiは、ミトコンドリアDNAの制限酵素解析によって少なくとも10数種類以上の遺伝子多型を有することが知られている。そこで、ATCC No.14284の菌株からDNA断片を分離し、複数の菌株で配列を比較し、多数の株に共通で、他の生物とは類似しない遺伝子にプライマーの設定を試みた。その結果、予備的に設定したプライマーでは30菌株中14株(46.7%)菌株でDNAの増幅がみられたのに対し、複数の菌株の塩基配列を考慮して作製したプライマーは、75菌株中69株(92%)でDNAの増幅が確認された。そして、その後さら多くの塩基配列を検討した。次に、実用上の感度向上のため、微量かつ強固な真菌から確実にDNAを抽出する方法を検討した。まず、Zymolyaseやlyticase等の複数の酵素について、スライドカルチャー上の菌体への作用を観察した結果、酵素処理だけでは細胞壁の十分な破壊は困難であると結論した。そして、物理的な破砕と酵素処理を組み合わせ、固い皮膚組織中の、極めて微量の胞子型の菌体から確実にDNAを抽出する方法が必要と考えられた。以上の結果を統合することで、より実用的なスポロトリコーシスのDNA診断法が可能であると考えられた。