X線結晶解析に基づくジオキシゲナーゼの構造生化学的解明

基于 X 射线晶体学的双加氧酶结构生化解析

• 批准号: 12780450
• 负责人: 田中 裕之
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Shiga University of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780450/
• 关键词: カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ; 非ヘム鉄; ニトロフェノール; 酸素添加酵素; 酸素の定量; 反応動力学; 結晶構造; 電荷移動錯体; X線結晶解析; オキシゲナーゼ; 酸素の活性化

カテコール2,3-ジオキシゲナーゼは、非ヘムFe^<2+>を補因子とする酵素で、その反応機構、特にO_2活性化機構の解明は、臨床面や環境浄化への応用的研究の基礎として重要である。結晶構造が解明されているextradiol型ジオキシゲナーゼの中で、Pseudomonas putida mt-2由来の本酵素は、反応機構解明に最も適している。そこで、今年度もニトロフェノール誘導体を中心に、物理化学的解析と複合体の結晶構造解析とを平行して進め、以下の成果が得られた。1,o-およびm-ニトロフェノールは活性部位でプロトンを脱離し、Fe^<2+>に二座配位する。一方、p-ニトロフェノールは、逆に、活性部位でプロトン付加される。さらに、前2者は、金属からリガンドへの電荷移動吸収帯と思われる吸収を長波長領域に示す。ES複合体がO_2を活性するが、その際、基質のカテコールはモノアニオンとして鉄に二座配位する。これらの結果は、活性部位のヒスチジンやチロシン残基の役割やpK値をフェノール誘導体との相互作用の解析から解明できることを明らかにした。2,酵素-ニトロフェノール複合体の精密立体構造を決めるため、良質の結晶の獲得を目指したが、現在のところ、リガンドに相当する明瞭な電子密度を得るには至っていない。しかし、ベンズアルデヒド誘導体の中に、o-ニトロフェノールより強く本酵素に結合するものを見つけ、これとの複合体の構造解析を現在検討中である。精密な原子座標に基づいて量子化学計算を行う予定である。3,活性酸素の産生なしに残存酸素を除去できるアスコルビン酸-アスコルビン酸酸化酵素系が、本酵素の低濃度液の安定な長時間保存に適していることを見つけ、詳しい反応動力学実験が容易に行える方法を確立した。同時に、4-クロロカテコールが微量酸素濃度定量に適していることを見だし、nMレベルのO_2濃度定量法を確立した。

カ テ コ ー ル 2, 3 - ジ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ は, non ヘ ム Fe ^ 2 + < > を fill factor と す る enzyme で, そ の 応 institutions, especially に O_2 activation agency の interpret は, clinical surface や environment at へ の 応 with basic と is の し て important で あ る. Crystal structure が interpret さ れ て い る extradiol type ジ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の で, Pseudomonas putida mt - 2 origin の, this enzyme は 応 agencies interpret に most も し て い る. そ こ で, our も ニ ト ロ フ ェ ノ ー ル inductor を center に analytical と complex の crystal structure, physical and chemical analytical と を parallel し て in め, the following の results が ら れ た. 1. The active site of o-およびm-ニトロフェノ ニトロフェノ ニトロフェノ ニトロフェノ the active site でプロト を を detaches from the <s:1> and Fe^<2+>に coordinates する. One side, p-ニトロフェノ ニトロフェノ ニトロフェノ に に に, reverse に, active site でプロト でプロト plus される. Youdaoplaceholder0, the first two さらに, metal らリガ らリガ ドへ ドへ ドへ the <s:1> charge movement absorption band と thought われる absorption を in the long wavelength field に shows す. ES complex が O_2 を active す る が, そ の interstate, matrix の カ テ コ ー ル は モ ノ ア ニ オ ン と し て iron objects に two ligand す る. こ れ ら の results は, active site の ヒ ス チ ジ ン や チ ロ シ ン residues cutting の service や pK numerical を フ ェ ノ ー ル inductor と の interaction の parsing か ら interpret で き る こ と を Ming ら か に し た. 2, enzyme - ニ ト ロ フ ェ ノ ー ル complex の precision three-dimensional structure を definitely め る た め, good quality の crystallization の を refers し た が, now の と こ ろ, リ ガ ン ド に quite す る clear な electron density を must る に は to っ て い な い. し か し, ベ ン ズ ア ル デ ヒ ド inductor の に, o - ニ ト ロ フ ェ ノ ー ル よ に strong り く the enzyme combined with す る も の を see つ け, こ れ と の complex の structure analytic を 検 now please で あ る. Precise な atomic coordinates に basis づ て て quantum chemical calculation を row う presetting である. 3, active acid element の な し に residual acid element を remove で き る ア ス コ ル ビ ン acid - ア ス コ ル ビ ン acid acidification enzyme が, this enzyme の low concentration liquid の settle な long time preservation に optimum し て い る こ と を see つ け and detailed し い anti 応 dynamics be 験 が line easily に え を る method established し た. に at the same time, 4 - ク ロ ロ カ テ コ ー ル が acid trace element concentration quantitative に optimum し て い る こ と を see だ し, nM レ ベ ル の O_2 concentration を quantitative method to establish し た.

项目成果

Kihachiro Horiike: "Distribution of D-amino-acid oxidase and D-serine in vertebrate brains"J.Mol.Catal.. 12B. 37-41 (2001)

Kihachiro Horiike：“D-氨基酸氧化酶和 D-丝氨酸在脊椎动物大脑中的分布”J.Mol.Catal.. 12B。

Hirofumi Nakajima: "Accurate measurement of near-micromolar oxygen concentrations in aqueous solutions based on enzymatic extradiol cleavage of 4-chrolocatechol: applications for improved low-oxygen experimental systems and quantitative assessment of the

Hirofumi Nakajima：“基于 4-氯代儿茶酚的酶促外二醇裂解，精确测量水溶液中近微摩尔氧浓度：改进低氧实验系统和定量评估的应用

Tetsuo Ishida: "Structure and reaction mechanism of catechol 2,3-dioxygenase(metapyrocatechase)"Excerpta Medica ICS 1233. (印刷中). (2002)

Tetsuo Ishida：“儿茶酚 2,3-双加氧酶（偏焦儿茶酶）的结构和反应机制”Excerpta Medica ICS 1233。（印刷中）。