In situハイブリダイゼーションによる骨変異モデルラットの解析

【目的】化学的変異源ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)を用いて京都大学動物実験施設で作出されたOune変異ラットは、優性突然変異系統であり尾椎の形成不全を指標として単離された。以前に行った透明骨格標本の解析において頸椎・仙椎・腰椎・尾椎で椎骨の数の減少や椎体・棘突起の欠失や融合が認められている。本研究ではOuneラットの脊椎形成異常における分子メカニズムを解析するため、14,5日胚を用いて組織切片の解析やIn situハイブリダイゼーション(ISH)法を用いて胎仔期の遺伝子発現を調べた。【方法】脊柱形態形成に異常が認められる時期(14.5日胚)の胎仔サンプルを採取し、パラフィン組織切片2を作製した。組織切片での解析はヘマトキシリン・エオジン(HE)染色とISH法を行った。ISH法は組織切片上でRNAプローブを用いて、組織中に発現するmRNAとハイブリダイズさせ、そのシグナルを検出することによって遺伝子発現を調べる方法である。椎骨は胎仔期の体節に由来するので、体節形成に関与する遺伝子群のRNAプローブを作製し、ISH法により発現パターンを解析した。【結果および考察】HE染色法では前半部の体節区分が欠け、尾部の体節も不明瞭だった。体節で発現するPaxl、Uncx4.1、DlllをISH法で解析した結果、Oune/+では体節前半部と尾部で体節形成に関与するUncx4.1、Dlll遺伝子の発現が低下しており、不規則なパターンを示した。以上の実験の結果から、これらの体節における遺伝子発現の異常が脊柱形成不全の原因となっていることが考えられた。体節は原腸陥入直後の傍軸中胚葉が分節化を伴って形成する基本単位であり、その分節化のメカニズムはまだ十分には解明されていない。今回の研究結果はOuneラットの原因遺伝子の変位部位の探索に役立つものと思われ、今後さらに他の関連遺伝子の発現について検索を進めていきたいと考えている。

【目的】化学的変異源ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)を用いて京都大学動物実験施設で作出されたOune変異ラットは、優性突然変異系統であり尾椎の形成不全を指標として単離された。以前に行った透明骨格標本の解析において頸椎・仙椎・腰椎・尾椎で椎骨の数の減少や椎体・棘突起の欠失や融合が認められている。本研究ではOuneラットの脊椎形成異常における分子メカニズムを解析するため、14,5日胚を用いて組織切片の解析やIn situハイブリダイゼーション(ISH)法を用いて胎仔期の遺伝子発現を調べた。【方法】脊柱形態形成に異常が認められる時期(14.5日胚)の胎仔サンプルを採取し、パラフィン組織切片2を作製した。組織切片での解析はヘマトキシリン・エオジン(HE)染色とISH法を行った。ISH法は組織切片上でRNAプローブを用いて、組織中に発現するmRNAとハイブリダイズさせ、そのシグナルを検出することによって遺伝子発現を調べる方法である。椎骨は胎仔期の体節に由来するので、体節形成に関与する遺伝子群のRNAプローブを作製し、ISH法により発現パターンを解析した。【結果および考察】HE染色法では前半部の体節区分が欠け、尾部の体節も不明瞭だった。体節で発現するPaxl、Uncx4.1、DlllをISH法で解析した結果、Oune/+では体節前半部と尾部で体節形成に関与するUncx4.1、Dlll遺伝子の発現が低下しており、不規則なパターンを示した。以上の実験の結果から、これらの体節における遺伝子発現の異常が脊柱形成不全の原因となっていることが考えられた。体節は原腸陥入直後の傍軸中胚葉が分節化を伴って形成する基本単位であり、その分節化のメカニズムはまだ十分には解明されていない。今回の研究結果はOuneラットの原因遺伝子の変位部位の探索に役立つものと思われ、今後さらに他の関連遺伝子の発現について検索を進めていきたいと考えている。