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心筋細胞内calpain活性の計測

心肌细胞钙蛋白酶活性的测量

基本信息

批准号：
08770497
负责人：
松村泰志
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770497/
关键词：
Ca Overload 単離心筋細胞 calpain fura red 7-amino-4-chloromethylcoumarin 顕微測光法

项目摘要

心筋の虚血・再潅流障害には、細胞内Caオーバーロードが重要な役割を担うことが知られているが、そのメカニズムは明らかにされていない。我々は、再潅流時に、Ca依存性に心筋内の構造蛋白が変化し、この変化はプロテアーゼ阻害剤で抑制されることから、再潅流障害にCa依存性プロテアーゼ(calpain)が関与する可能性を示してきた。しかし、心筋細胞内Caオーバーロード時に、calpain活性が亢進するかは確認されていない。そこで本年度は、細胞内Ca濃度とcalpain活性を同時に計測する系を確立し、心筋細胞内でのcalpain活性動態を調べた。成熟モルモットの心臓から、心筋細胞を単離し、細胞内Ca濃度をfura redにより、calpain活性を7-amino-4-chloromethylcoumarin,t-BOC-L-methinine amide (Boc-Leu-Met-CMAC)(calpainで分解され7-amino-4-methylcoumarinとなると蛍光を発する)により計測した。この2種類の蛍光物質を細胞内に取り込ませ、360nm、420nmの2波長で励起し、fura redと7-amino-4-methylcoumarinの蛍光を分離し、顕微測光法にて測定した。細胞内Ca濃度は、細胞外のNaClをcholine Clで置換した液で潅流することにより上昇させた。Na freeで潅流してしばらくして細胞内Ca濃度が上昇し始め、123±43(mean±SEM)秒遅れてcalpain基質の蛍光が増加することが確認された。この時点で細胞形状はやや短縮しているが、完全なsquareとなるのは、calpainの活性化が起こった後であり、蛍光色素の流出(細胞膜の変化を示す)は、細胞内Ca濃度上昇開始498±170秒後に起こり始めた。以上から、心筋細胞内では、わずかな細胞内Ca濃度の上昇に伴ってcalpain活性が亢進すること、細胞形状の変化は、calpainの活性化後に起こることが確認された。

Insufficiency of blood in the heart muscles, damage to the blood circulation, and important intracellular Ca オーバーロードがそのメカニズムは明らかにされていない. I 々は, re-flow time, Ca-dependent structural protein in the heart muscle が変化し, この変化はプロテアーゼ hindering 剤で inhibit されることから、Re-flow obstacle にCa dependency プロテアーゼ(calpain) が口 and する possibility をshow してきた.しかし、Caオーバーロード时に、Calpain activity in myocardial cells is confirmed to be elevated. In this year, the intracellular Ca concentration and calpain activity were simultaneously measured, the system was established, and the calpain activity dynamics in cardiac muscle cells were adjusted. Mature モルモットの心臓から, cardiac muscle cells を単利し, intracellular Ca concentration をfura red により, calpain activity 7-amino-4-chloromethylcoumarin,t-BOC-L-methinine amide (Boc-Leu-Met-CMAC)(calpainでdegradationされ7-amino-4-methylcoumarinとなると蛍光を発する)によりmeasurementした. 2 kinds of light substances are taken out in cells, 2 wavelengths of 360nm and 420nm are used to excite the light, fura red is used to separate 7-amino-4-methylcoumarin light, and microphotometry is used to measure it. The concentration of intracellular Ca and the replacement of extracellular NaCl and choline Cl are the same. Na free で潅流してしばらくして intracellular Ca concentration rises しInitially, 123±43(mean±SEM) seconds ぅ荌てcalpain matrix の蛍光が Increase adds することがconfirms された. After the timing of the cell shape, the shortening of the cells, the complete square shape, and the activation of calpain The efflux of photopigment (the change of cell membrane) starts 498±170 seconds after the intracellular Ca concentration rises. The above results show that the increase in intracellular Ca concentration in myocardial cells and cardiac muscle cells is accompanied by calpain activity. Confirmation of hyperactivity, cell shape change, and activation of calpain.