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アルツハイマー病脳のアミロイドβ蛋白生成酵素の同定に関する分子生物学的研究

阿尔茨海默病脑中β-淀粉样蛋白产生酶鉴定的分子生物学研究

基本信息

批准号：
08770781
负责人：
続佳代
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Sapporo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至 1997
项目状态：
已结题

项目摘要

クロロキンミオパチーはアルツハイマー病のアミロイド病変のモデルと考えられる。この筋病変を用いた本研究によって以下のことを明らかにした。1.この筋病変の経時的変化を抗Aβ抗体を用いた免疫染色で観察すると、クロロキン投与14日目より空胞内や空胞周囲が染色された。投与14日目の切片にAβ40、Aβ42を認識する断端特異抗体(BC40、BC42)を用いて染色すると、抗Aβ抗体で染色されるほぼ半数がBC42で、また一部がBC40でも染色された。この筋病変ではAβ42が優位であり、Aβ40、Aβ42のN端ならびにC端を切断するβ、γ-セクレターゼが実際に存在していることを明らかにした。2.この病変筋にAβが存在するか否かを生化学的に検討した。病変ヒラメ筋を各種プロテアーゼインヒビター添加リン酸緩衝液中でホモジナイズし、蛋白を可溶化した。Tris-tricine電気泳動後PVDFメンブランに転写し、抗Aβ抗体にて免疫反応を行った。投与14日目より、抗Aβ抗体と反応する3、および4kDaの明瞭なバンドが検出された。この3および4kDaの断片は、p3ならびにAβに相当すると考えられる。現在sequencingを試みている。3.セクレターゼを同定するために、病変ヒラメ筋をEDTA添加リン酸緩衝液中でホモジナイズし、遠心法により抽出液(粗酵素液)を得た。この粗酵素液に組み換え大腸菌より精製したアミロイド前駆体蛋白(APP)を加え、APPの処理過程を経時的に観察した。粗酵素液を作用させたAPPには未処理APPにはみられない幾つかのAβに関連する断片がみられた。このバンドをdirect microsequencing法にてアミノ酸配列の決定を試みている。また、基質として大腸菌由来のAPPより純度の高いAβのN端、およびC端を含む合成ペプチドを用いて同様の検討を行いセクレターゼの同定を試みている。

The number of people who died in the accident was 10,000. This study is based on the following findings: 1. The changes in muscle tissue during development were detected by immunostaining with anti-A β antibody. Aβ40 and Aβ42 were recognized in the 14-day-old sections and were stained with BC40 and BC42 antibodies. Half of the Aβ antibodies were stained with BC42 and some with BC40. Aβ42 is in the optimal position, Aβ40 and Aβ42 are in the N-terminal position, and Aβ40 and A β 42 are in the C-terminal position. 2. The presence or absence of Aβ in this disease is discussed in biochemical terms. The protein is solubilized in an acid buffer solution. After Tris-tricine electrophoresis PVDF molecules were detected and anti-A β antibodies were detected. After 14 days of administration, anti-A β antibodies were detected at levels of 3, 7 and 4 kDa. The 3 kDa and 4 kDa fragments were found to be related to Aβ. Now sequencing is trying. 3. To obtain the extract solution (crude enzyme solution) by adding EDTA to the acid buffer solution. The crude enzyme solution is composed of E. coli, purified and precursor protein (APP), and the processing process of APP is monitored. The crude enzyme solution acts on the untreated APP, and the Aβ-related fragments are removed. The direct microequencing method is used to determine the acid sequence. The N-terminal, C-terminal and C-terminal of Aβ were synthesized from APP of high purity and substrate origin.