タンパク質発現のための無細胞タンパク質合成系

点击翻译按钮获取中文摘要

無細胞タンパク質合成系では,生細胞を用いた発現系で問題となる生体維持機構の制約を受けにくく,しかも,系自体を人為的に改変することにより,目的タンパク質の発現に最適化したり,生細胞を用いた発現系では調製不可能なタンパク質を調製することが可能である.このような無細胞系の特色を利用した発現技術として,コドンとtRNAの対応関係を巧妙に利用することにより,タンパク質上の特定の位置に特定の(20種のアミノ酸とは限らない)アミノ酸を,特異的に導入する方法がある.ところがこの方法では,極めて少量(μgオーダー)のタンパク質しか得られず,タンパク質の機能構造研究への利用は極めて困難であった.この技術を利用して,タンパク質の特定の残基のみを安定同位体標識することができれば,これまでは解析が困難であった,分子量が数万以上のタンパク質,及びタンパク質間相互作用を,NMRを用いて迅速に解析することが可能になり,構造生物学が更に進展すると期待されるが,極めて少ない合成量が大きな問題であった.そこで,研究代表者がこれまでに開発してきた無細胞大量発現技術と,tRNAの大量調製技術を組み合わせ,更に,これまでの無細胞系に関する知見を基に各種反応条件を検討することにより,この部位特異的タンパク質安定同位標識技術を実用化することに成功した.この技術を用いて,Rasタンパク質の標的分子との相互作用を担うエフェクター領域にある32位のチロシン残基のみに,^<15>N標識が導入されたRasタンパク質を,mgオーダーで調製してNMRスペクトルを測定することに成功した.