タンパク質発現のための無細胞タンパク質合成系

用于蛋白质表达的无细胞蛋白质合成系统

• 批准号: 08780570
• 负责人: 木川 隆則
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780570/
• 关键词: タンパク質; 無細胞タンパク質合成系; 安定同位体標識; NMR; 部位特異的標識; 高次構造; tRNA; 発現系

無細胞タンパク質合成系では,生細胞を用いた発現系で問題となる生体維持機構の制約を受けにくく,しかも,系自体を人為的に改変することにより,目的タンパク質の発現に最適化したり,生細胞を用いた発現系では調製不可能なタンパク質を調製することが可能である.このような無細胞系の特色を利用した発現技術として,コドンとtRNAの対応関係を巧妙に利用することにより,タンパク質上の特定の位置に特定の(20種のアミノ酸とは限らない)アミノ酸を,特異的に導入する方法がある.ところがこの方法では,極めて少量(μgオーダー)のタンパク質しか得られず,タンパク質の機能構造研究への利用は極めて困難であった.この技術を利用して,タンパク質の特定の残基のみを安定同位体標識することができれば,これまでは解析が困難であった,分子量が数万以上のタンパク質,及びタンパク質間相互作用を,NMRを用いて迅速に解析することが可能になり,構造生物学が更に進展すると期待されるが,極めて少ない合成量が大きな問題であった.そこで,研究代表者がこれまでに開発してきた無細胞大量発現技術と,tRNAの大量調製技術を組み合わせ,更に,これまでの無細胞系に関する知見を基に各種反応条件を検討することにより,この部位特異的タンパク質安定同位標識技術を実用化することに成功した.この技術を用いて,Rasタンパク質の標的分子との相互作用を担うエフェクター領域にある32位のチロシン残基のみに,^<15>N標識が導入されたRasタンパク質を,mgオーダーで調製してNMRスペクトルを測定することに成功した.

The cell-free quality synthesis system is a problem in which the biological cell development system is subject to the restriction of the biological maintenance mechanism, and the objective is to optimize the quality of the biological cell development system. The characteristics of this cell line are utilized to develop techniques for the ingenious utilization of tRNA interactions in specific locations on the surface of the cell line (20 different acids). The method of this paper is very difficult to use. This technique is used to identify stable isotopes at specific residues of different species. It is difficult to analyze these species with molecular weights of tens of thousands or more. It is also possible to analyze them rapidly with NMR. It is expected that structural biology will make further progress. In this paper, research representatives have successfully developed cell-free mass discovery technology,tRNA mass modulation technology, and cell line-free knowledge base, discussed various reaction conditions, and implemented site-specific protein stability labeling technology. This technique was successfully applied to the determination of <15>Ras protein by NMR.

项目成果

Kim, D.-M.: "A Highly Efficient Cell-free Protein Synthesis System from Escherichia coli" Eur.J.Biochem.239. 881-886 (1996)

Kim, D.-M.：“一种高效的大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统”Eur.J.Biochem.239。