無細胞タンパク質合成系を用いた多品種同時調製システムの開発

利用无细胞蛋白质合成系统开发多产品同时制备系统

• 批准号: 12780502
• 负责人: 木川 隆則
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780502/
• 关键词: 無細胞タンパク質合成; タンパク質発現; High throughput; cDNA発現; 構造・機能ゲノム科学; high throughput

大腸菌S30抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を核として,ゲノムにコードされた多数のタンパク質を,同時並行で,迅速に発現調製する系を確立することを目的として,今年度は以下の研究を進めた.タンパク質の高次構造を調べる場合,適切にフォールディングした,構造解析に適した試料を調製する必要がある.タンパク質のアミノ酸配列とフォールディングの相関関係について,これまでに得られている知見からは,残念ながら,対象となるタンパク質が適切にフォールディングするかどうかを予測することは難しい.そのため,対象タンパク質が構造解析に適した試料となるかどうかは,実験的な手法により調べる必要がある.この目的において,1H-15N HSQC NMRスペクトルは極めて有用な情報を与えてくれる.そこで,HSQCスペクトルを測定するために必要な15N標識タンパク質の調製・精製を,ハイスループットで行う系を開発した.まず,試料は発現Tag(His-tagなど)との融合体で発現するために,昨年度開発した二段階PCR法を用いて発現鋳型を調製した.測定に必要なmgオーダーの試料を同時に多数得るために,3mLスケールの透析反応を同時並行して行うことにした.合成後の目的タンパク質は,ロボットを用いて,アフィニティークロマトグラフィー法で精製することにした.このプロトコールに従うことにより,24検体の15N標識タンパク質が,実験開始から24時間以内に得られるようになり,NMR測定を含めても2日以内に,24対象試料に関する構想解析適性情報が得られることになった.これまでは,1試料に関する情報を得るのに,数日間以上かかっていたことから,本研究の成果により,飛躍的に効率が上がったことになる.

The extraction solution of Rhizoctonia S30 was used to synthesize the nucleic acid of the yeast S30, and most of them were tested at the same time. The following studies have been carried out this year. This is the first time to make a good match, and then to make the necessary information. I don't know, I don't know. You can't tell me how to make an analysis, just like the way you use it, the way you do it, the way you do it, the way you need it. The purpose of this article is to help you know that 1H-15N HSQC NMR is very useful for you. As a matter of fact, HSQC is responsible for determining that it is necessary to apply 15N standards to improve the accuracy of the registration system. In order to improve the performance of the Tag (His-tag transmission) fusion system, the two-stage PCR method was launched last year. Most of the necessary mg test materials are not available at the same time, and the 3mL test equipment is used at the same time. After the synthesis, the purpose of the synthesis is to improve the quality of the system. If you don't want to know if you want to analyze your sexual information, if you do not know what to do, if you do not know what to do within 24 hours, the NMR test will be valid within 2 days, and the 24-year-old system wants to analyze your sexual information. In the past few days, the results of this study have been satisfactory, and the rate of failure has been higher than that of the previous one.

项目成果

Kigawa, T.: "Selenomethionine incorporation into a protein by cell-free synthesis"J. Struct. Func. Genomics. 2. 29-35 (2001)

Kikawa, T.：“通过无细胞合成将硒代蛋氨酸掺入蛋白质中”J。

木川隆則: "無細胞系を用いたタンパク質の大量合成"生物物理. 232. 391-394 (2000)

Takanori Kikawa：“使用无细胞系统进行大规模蛋白质合成”生物物理学 232. 391-394 (2000)。

Yokoyama,S.: "Structural genomics projects in Japan"Nat.Struct.Biol.. 7 Suppl.. 943-945 (2000)

Yokoyama,S.：“日本的结构基因组学项目”Nat.Struct.Biol.. 7 Suppl.. 943-945 (2000)

Hirao, I.: "An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs into proteins"Nat. Biotechnol.. 20. 177-182 (2002)

Hirao，I.：“用于将氨基酸类似物掺入蛋白质中的非天然碱基对”Nat。

木川 隆則: "構造ゲノム科学研究の流れと成果"実験医学. 19. 945-949 (2001)

Takanori Kikawa：“结构基因组科学研究的流程和结果”实验医学 19. 945-949 (2001)。