無細胞タンパク質合成系を用いた多品種同時調製システムの開発

利用无细胞蛋白质合成系统开发多产品同时制备系统

• 批准号: 12780502
• 负责人: 木川 隆則
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780502/
• 关键词: 無細胞タンパク質合成; タンパク質発現; High throughput; cDNA発現; 構造・機能ゲノム科学; high throughput

大腸菌S30抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を核として,ゲノムにコードされた多数のタンパク質を,同時並行で,迅速に発現調製する系を確立することを目的として,今年度は以下の研究を進めた.タンパク質の高次構造を調べる場合,適切にフォールディングした,構造解析に適した試料を調製する必要がある.タンパク質のアミノ酸配列とフォールディングの相関関係について,これまでに得られている知見からは,残念ながら,対象となるタンパク質が適切にフォールディングするかどうかを予測することは難しい.そのため,対象タンパク質が構造解析に適した試料となるかどうかは,実験的な手法により調べる必要がある.この目的において,1H-15N HSQC NMRスペクトルは極めて有用な情報を与えてくれる.そこで,HSQCスペクトルを測定するために必要な15N標識タンパク質の調製・精製を,ハイスループットで行う系を開発した.まず,試料は発現Tag(His-tagなど)との融合体で発現するために,昨年度開発した二段階PCR法を用いて発現鋳型を調製した.測定に必要なmgオーダーの試料を同時に多数得るために,3mLスケールの透析反応を同時並行して行うことにした.合成後の目的タンパク質は,ロボットを用いて,アフィニティークロマトグラフィー法で精製することにした.このプロトコールに従うことにより,24検体の15N標識タンパク質が,実験開始から24時間以内に得られるようになり,NMR測定を含めても2日以内に,24対象試料に関する構想解析適性情報が得られることになった.これまでは,1試料に関する情報を得るのに,数日間以上かかっていたことから,本研究の成果により,飛躍的に効率が上がったことになる.

Escherichia coli S30 extract is used in cell-free protein synthesis system, and most of the proteins are produced simultaneously, and the modulation system is rapidly developed. In the case of high-order structural adjustment, it is necessary to adjust the structural analysis. The relationship between the two groups is very important. For example, if you want to adjust the structure of the sample, you can adjust the structure of the sample. For this purpose,1H-15N HSQC NMR was used to provide useful information. HSQC is the essential ingredient for the determination of HSQC. In addition, the fusion of Tag(His-tag) and sample was detected by two-stage PCR method. Determination of the necessary mg of the sample at the same time,3mL of the dialysis reaction at the same time After the synthesis, the quality of the product was improved. NMR measurements were performed within 2 days, 24 samples were analyzed for suitability information, 15N identification was performed within 24 days, 24 samples were analyzed for suitability information. The results of this study show that there is a significant increase in the efficiency of this study.

项目成果

Kigawa, T.: "Selenomethionine incorporation into a protein by cell-free synthesis"J. Struct. Func. Genomics. 2. 29-35 (2001)

Kikawa, T.：“通过无细胞合成将硒代蛋氨酸掺入蛋白质中”J。

木川隆則: "無細胞系を用いたタンパク質の大量合成"生物物理. 232. 391-394 (2000)

Takanori Kikawa：“使用无细胞系统进行大规模蛋白质合成”生物物理学 232. 391-394 (2000)。

Yokoyama,S.: "Structural genomics projects in Japan"Nat.Struct.Biol.. 7 Suppl.. 943-945 (2000)

Yokoyama,S.：“日本的结构基因组学项目”Nat.Struct.Biol.. 7 Suppl.. 943-945 (2000)

Hirao, I.: "An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs into proteins"Nat. Biotechnol.. 20. 177-182 (2002)

Hirao，I.：“用于将氨基酸类似物掺入蛋白质中的非天然碱基对”Nat。

木川 隆則: "構造ゲノム科学研究の流れと成果"実験医学. 19. 945-949 (2001)

Takanori Kikawa：“结构基因组科学研究的流程和结果”实验医学 19. 945-949 (2001)。