糖鎖付加を伴う無細胞タンパク質合成系の機能化

糖基化无细胞蛋白质合成系统的功能化

基本信息

  • 批准号:
    14656137
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.86万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Exploratory Research
  • 财政年份:
    2002
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2002 至 2003
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

細胞におけるタンパク質へのN型糖鎖の付加は小胞体、ゴルジ体、小胞輸送、膜との融合等の細胞内諸器官を経由し、多様性に富む様々な種類の糖転移酵素による酵素反応の集積プロセスとして行われている。このような小胞輸送経路に翻訳産物が移行するには細胞内移行シグナルが重要な役割を果たしている。本技術シーズではin vivo系と同様にin vitro系においても分泌シグナルが機能し、試験管内であるにもかかわらず小胞輸送経路が再構築されているものと考えられる。このプロセスを移行する過程で糖鎖のトリミングを受け、糖タンパク質が合成されている。窒素ガスを利用した加圧型細胞破砕装置で調製した昆虫細胞抽出液を用いて合成した翻訳産物VP1には糖鎖が付加されたgVP1であった。PNGaseF処理の結果、gVP1はメディアルゴルジで修飾される糖鎖と同様な糖鎖が付加されていること、プロテアーゼ抵抗性を示したことから翻訳産物gVP1はオルガネラ内腔に存在し、そのオルガネラはゴルジ体内に存在することが明らかになった。したがって、本研究開発事業の技術シーズである昆虫細胞抽出液の中には糖鎖付加を司るオルガネラが安定に存在し、細胞内移行シグナルに依存した小胞輸送により糖鎖修飾が行われることが明らかになった。さらに、合成された翻訳産物は小胞輸送経路を経てゴルジ体へ移行していることが示唆された。一方、部分精製を行ったgVP1タンパク質のレクチンとの結合性の検討結果から、付加された糖鎖を構成する糖としてマンノース及びフコースが確実に存在することが明らかになった。しかし、糖鎖を構成する糖とレクチンとの親和力の強弱がレクチン結合性の判定に大きく影響を与える。現在、モデル系としてSf21細胞で発現した糖鎖が付加したVP1をLC-MSによる糖鎖構造の解析に着手している。得られたin vivoレベルでの糖鎖構造をベースに、in vitro系で合成されたVP1に付加された糖鎖構造を早急に決定したい。
The N-type glycogen lock in the cytoplasm of the cell increases the accumulation of enzymes in various intracellular organs, such as vesicles, and membrane fusions. The cellular transport pathway is responsible for the migration of products. The technology is similar to that of the vivo system and the vitro system, and the function of the secretion system is reconstructed. During the process of transition, the sugar chain is converted into sugar chain, and the sugar chain is synthesized. The protein was synthesized by using a high pressure cell disruption device. As a result of the PNGase F treatment, gVP1 was found to be resistant to the presence of sugar in the lumen of the cell, and the presence of sugar in the body. This study developed a technology for the development of insect cell extracts, which is characterized by the presence of glycogen in the extract, the dependence of intracellular migration on cellular transport, and the modification of glycogen. In addition, the synthesis of these products is a process of cellular transport. A party, part of the refining process gVP1, the quality of the product, the combination of the results of the study, the addition of sugar lock composition sugar, and the existence of the product. The determination of the affinity of the sugar chain and the sugar chain composition has a great influence on the determination of the binding property of the sugar chain. Now, the glycan structure analysis of VP1 and LC-MS cells has been started. In vivo, the glycan structure was determined in vitro and in vitro.

项目成果

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