無細胞タンパク質合成系を用いた新規のタンパク質安定同位体標識法の開発と応用

利用无细胞蛋白质合成系统开发和应用新型蛋白质稳定同位素标记方法

• 批准号: 08260222
• 负责人: 木川 隆則
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08260222/
• 关键词: タンパク質; 無細胞タンパク質合成系; 安定同位体標識; NMR; 部位特異的標識; 高次構造; tRNA; 発現系

無細胞系タンパク質合成系では,コドンとtRNAの対応関係をうまく利用することにより,タンパク質上の特定の位置に(20種のアミノ酸には限らず)任意のアミノ酸を導入することが可能である.この技術を応用することにより,タンパク質の特定残基だけを安定同位体標識することが可能となり,巨大分子の動的な局所構造をNMRを用いて調べたり,固体NMR法により精密な距離測定が可能になるなど,NMRを用いた構造解析に与えるインパクトは大きいと考えられる.ところが,従来のこの技術では,極めて少量(μgオーダー)のタンパク質しか得られず,構造解析にとっては実用的な技術とは言えなかった.そこで,本年度は,我々がこれまでに開発してきた,無細胞大量発現技術とtRNAの大量調製技術を組み合わせ,更に,これまでに得られた無細胞系に関する知見を基に,各種反応条件を検討をおこなった.その結果,位置特異的安定同位体標識タンパク質を,NMR測定に十分な量(mgオーダー)得ることのできる,無細胞発現法を確立することに成功した.次に,この技術を用いて,Rasタンパク質において,標的分子との相互作用を担うエフェクター領域にある32位のチロシン残基のみに,^<15>N標識を導入することを試みた.あらかじめ,^<15>N標識チロシンをチャージさせたアンバーサプレッサーtRNAを,32位に相当するコドンをアンバーコドンに置換した鋳型DNAと共に用いて,無細胞タンパク質合成反応(30mlスケール)をおこない,32位のチロシン残基のみ^<15>N標識されたRasタンパク質を得た(最終収量2.2mg).この試料のHSQCスペクトルを測定し,32位のみが^<15>N標識されていることを確認した.

在无细胞蛋白质合成系统中，通过充分利用密码子和tRNA之间的对应关系，可以在蛋白质上的特定位置引入任何氨基酸（不限于20个氨基酸）。通过应用这项技术，可以仅将蛋白质的特定残基标记为稳定的同位素，并且可以使用NMR检查大分子的动态局部结构，并可以使用固态NMR进行精确的距离测量，从而使NMR的结构成为可能。但是，该技术仅产生极少量的蛋白（按μg）蛋白质，因此不可能说它是结构分析的实用技术。因此，今年，我们将大规模的无细胞表达技术和我们到目前为止开发的大规模tRNA制备技术结合在一起，并且基于到目前为止所获得的知识，我们拥有各种不同的抗体抗体抗体抗体抗体抗体敏感。然后成功地建立了一种检查反应的条件，该方法允许特定位置特异性稳定的同位素标记蛋白进行足够量（按Mg的顺序）进行NMR测量。接下来，使用这种技术，我们尝试将 ^<15> n标签引入仅在效应区域的位置32处的酪氨酸残基，负责与RAS蛋白中的靶分子相互作用。事先，我们使用该技术引入 ^<15> n标签。使用模板DNA的合成琥珀色抑制剂tRNA进行无细胞蛋白的合成反应（30 mL尺度），其中用琥珀色密码子代替了与位置32相对应的密码子，然后将RAS蛋白在位置32处标记为 ^<15> n（最终产量：2.2 mg）。测量了该样品的HSQC频谱，并确认仅位置32标记为 ^<15> n。