無細胞タンパク質合成系を用いた新規のタンパク質安定同位体標識法の開発と応用

利用无细胞蛋白质合成系统开发和应用新型蛋白质稳定同位素标记方法

• 批准号: 08260222
• 负责人: 木川 隆則
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08260222/
• 关键词: タンパク質; 無細胞タンパク質合成系; 安定同位体標識; NMR; 部位特異的標識; 高次構造; tRNA; 発現系

無細胞系タンパク質合成系では,コドンとtRNAの対応関係をうまく利用することにより,タンパク質上の特定の位置に(20種のアミノ酸には限らず)任意のアミノ酸を導入することが可能である.この技術を応用することにより,タンパク質の特定残基だけを安定同位体標識することが可能となり,巨大分子の動的な局所構造をNMRを用いて調べたり,固体NMR法により精密な距離測定が可能になるなど,NMRを用いた構造解析に与えるインパクトは大きいと考えられる.ところが,従来のこの技術では,極めて少量(μgオーダー)のタンパク質しか得られず,構造解析にとっては実用的な技術とは言えなかった.そこで,本年度は,我々がこれまでに開発してきた,無細胞大量発現技術とtRNAの大量調製技術を組み合わせ,更に,これまでに得られた無細胞系に関する知見を基に,各種反応条件を検討をおこなった.その結果,位置特異的安定同位体標識タンパク質を,NMR測定に十分な量(mgオーダー)得ることのできる,無細胞発現法を確立することに成功した.次に,この技術を用いて,Rasタンパク質において,標的分子との相互作用を担うエフェクター領域にある32位のチロシン残基のみに,^<15>N標識を導入することを試みた.あらかじめ,^<15>N標識チロシンをチャージさせたアンバーサプレッサーtRNAを,32位に相当するコドンをアンバーコドンに置換した鋳型DNAと共に用いて,無細胞タンパク質合成反応(30mlスケール)をおこない,32位のチロシン残基のみ^<15>N標識されたRasタンパク質を得た(最終収量2.2mg).この試料のHSQCスペクトルを測定し,32位のみが^<15>N標識されていることを確認した.

A cell-free line is a plasma-synthesizing line. It is possible to introduce any of the 20 different acids into a specific site on the plasma-producing line. This technique is useful in determining the molecular structure of a large molecule. NMR is useful in determining precise distances. A small amount of (μg) is used to analyze the structure of the structure, and the technology of the structure is used to analyze the structure. This year, we have developed cell-free mass-production techniques and tRNA mass-modulation techniques, and we have developed cell-free mass-production techniques and tRNA mass-modulation techniques. As a result, a position-specific stable isotope marker was obtained in tenths of a mg (ー ー) for NMR measurements, and a cell-free discovery method was successfully established. In addition, this technology is applied to the introduction of Ras, the interaction of the target molecule, and the interaction of the target molecule<15>. The <15>32nd position of the DNA fragment was identified by the 32nd position of the DNA fragment. The 32nd position of the DNA fragment was identified by the 32nd position of the DNA fragment. The 32nd position of the DNA fragment was identified by the 32nd position of the DNA fragment<15>. HSQC of the sample was determined, and the 32-bit HSQC was identified<15>.

项目成果

Kim, D.-M.: "A Highly Efficient Cell-free Protein Synthesis System from Escherichia coli" Eur.J.Biochem.239. 881-886 (1996)

Kim, D.-M.：“一种高效的大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统”Eur.J.Biochem.239。