タンパク質の機能構造研究のための無細胞合成系

用于蛋白质功能结构研究的无细胞合成系统

• 批准号: 10780374
• 负责人: 木川 隆則
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10780374/
• 关键词: 無細胞タンパク質合成; タンパク質発現; 安定同位体標識; NMR; high throughput; cDNA発現; X線結晶解析; 重原子同型置換

大腸菌抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系に関して,これまでの研究成果により,合成量は,生細胞を用いた発現系に匹敵するレベルにまで達している.さらに,無細胞系では,PCR増幅したDNA断片を,そのままタンパク質合成の鋳型として利用できるため,目的DNA断片の発現ベクターヘのクローニングという,従来必要であった煩雑な操作を経ることなく,コードされたタンパク質を調製することが可能である.そこで本年は,無細胞タンパク質合成系を核として,多数のDNAにコードされたタンパク質を,同時並行的に迅速に発現調製する,high throughputタンパク質発現系を確立することを目指した.系の流れとしては,各々のcDNA断片に固有のプライマーセットを用いた1段階目のPCR反応と,発現調節配列(プロモーター,ターミネーター,SD配列など)やTag配列(His-tagやGST-tagなど)を持つ共通プライマーセットによる2段階目のPCR反応を,引き続きおこない,発現用の鋳型DNA断片を作成する.次に,この鋳型を用いた無細胞タンパク質合成により,DNA断片にコードされたタンパク質を発現して解析する.すべての反応は,96穴マイクロプレート上で行い,多数試料の同時処理を可能とする.実際に,無作為に選んだマウスのcDNA 87クローンを,His-tag fusionの形で発現した結果,0.1mg/ml以上の比較的高い合成量が,24クローンについて得られ,また,クローン中で最も大きな分子量214kDaのタンパク質の合成も確認できた.さらに,目的cDNAクローンのPCR増幅から開姶して,発現量や可溶性の解析結果を得るまでに必要な時間は約12時間と,極めて短時間であった.この結果から,多数のタンパク質を,同時並行的に,迅速に発現調製する系を確立できたと考えられる.

The results of this research show that the amount of synthesis is comparable to that of cell-free production systems in Escherichia coli extracts. In addition, in cell-free lines,PCR amplification of DNA fragments, the development of DNA fragments of interest, and the use of DNA fragments of interest in gene synthesis are necessary for the manipulation of DNA fragments, and the modulation of DNA fragments is possible. This year, cell-free DNA synthesis systems have been established, and most DNA synthesis systems have been developed rapidly and simultaneously, with high throughput. The sequence of DNA fragments is composed of 1-level PCR reaction, 2-level PCR reaction, 2-level PCR reaction, and 2-level PCR reaction. In addition, this type of DNA is used in cell-free DNA synthesis,DNA fragmentation, and DNA analysis. In addition, the 96-hole reactor can be used for simultaneous processing of most samples. In fact, there is no selection of the cDNA 87 kD,His-tag fusion form found, 0.1 mg/ml or more of the comparative high synthesis amount, 24 kD, the largest molecular weight of 214kDa, His-tag fusion synthesis confirmed. In addition, PCR amplification of target cDNA was initiated, and the necessary time to obtain the quantitative and soluble analysis results was about 12 minutes, which was extremely short. As a result, most of them are in parallel, and the modulation system is quickly established.

项目成果

Kigawa T.: "Cell-free production and stable-isotope labeling of milligram quantities of proteins"FEBS Lett.. 442. 15-19 (1999)

Kikawa T.：“毫克量蛋白质的无细胞生产和稳定同位素标记”FEBS Lett.. 442. 15-19 (1999)

T.Kigawa: "Cell-free production and stable-isotope labeling of milligram quantities of proteins" FEBS Letters. 442. 15-19 (1999)

T.Kikawa：“毫克量蛋白质的无细胞生产和稳定同位素标记”FEBS Letters。

T.Yabuki: "Dual amino acid-selective and site-directed stable-isotope labeling of the human c-Ha-Ras protein by cell-free synthesis" Journal of Biomolecular NMR. 11. 295-306 (1998)

T.Yabuki：“通过无细胞合成对人类 c-Ha-Ras 蛋白进行双氨基酸选择性和定点稳定同位素标记”《生物分子 NMR 杂志》。