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骨髄由来巨核球の分化成熟過程におけるトロンボポエチン受容体発現機構の解析

骨髓源性巨核细胞分化成熟过程中血小板生成素受体表达机制分析

基本信息

批准号：
10771001
负责人：
春原正隆
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The Nippon Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771001/
关键词：
巨核球トロンボポエチントロンボポエチン受容体

项目摘要

米国ジェネンテイック社は、我々と共同で、CMK細胞にc-mpl遺伝子[トロンボポエチン(TPO)受容体遺伝子]が発現していることを利用し、世界に先駆けてTPOの発現とその遺伝子の単離に成功した(Nature369:533-538,1994)。また、KaushanskyらによりマウスTPOが、CMKの分化誘導を行うことが示され、さらにTPOがendomitosisをも惹起する強力な分化誘導因子であることが判明した(Nature369:568-571,1994)。そこで、CMK細胞を用いて、TPO分化誘導時におけるc-Mpl蛋白発現状況の経時的変化およびc-mpl遺伝子mRNA,c-mpl遺伝子プロモーター活性の変化を各々解析し、巨核球分化成熟過程におけるTPO受容体発現機構の解析および分化誘導時における形態的変化について検討を加えることを目的とし研究を行ないました。1)巨核球細胞表面上のc-Mpl発現状況の経時的変化に関しては、FACSによる解析が非常に困難で、市販されている唯一の抗体である米国ジェンザイムの社c-Mpl抗体では結果が得られなかったため、米国ZYMOGENETICS社に依頼した結果、FACS解析可能なc-Mpl抗体を特別に分与してもらえることになった。そこで、この抗体を用いてCMK細胞を米国ジェネンテック社より特別に分与されたTPOにて分化誘導後、細胞表面上のトロボポエチン(TPO)受容体(c-Mpl)発現の経時的変化をFACSにて解析したところ、TPO処理後1時間で細胞表面上のc-Mpl[トロボポエチン(TPO)受容体]のダウンレギュレーションが認められた。その後TPO処理後3時間でc-Mpl[トロンボポエチン(TPO)受容体]のダウンレギュレーションが最大となり、その後はアップレギュレーションすることを確認いたしております。2)さらに、上記のFACS解析と同じ条件下でのTPO処理によるc-Mpl発現状況の経時的変化を、米国ジェンザイム社のc-Mpl抗体にて免疫沈降法およびウエスタンブロッテイング法にて解析を試みたが結果が得られませんでした。現在、免疫沈降法およびウエスタンブロテイング法解析可能なc-Mpl抗体を特別に分与して頂けることになっており今後TPO分化誘導時におけるTPO受容体数変化を定量的に解析検討したいと考えております。3)米国ジェネンテック社より特別に分与されたトロンボポエチン(TPO)にてCMK細胞の分化誘導を行い、TPO分化誘導時におけるCMK細胞のc-mpl遺伝子プロモーター活性の経時的変化に関しましては、c-Mpl[トロボポエチン(TPO)受容体]のアップレギュレーションに呼応するようにTPO処理後24時間でc-mpl遺伝子プロモーター活性はピークを迎え、以降減衰し、TPO処理前の活性に戻ることを確認いたしております。

The development and utilization of c-mpl gene in CMK cells has been successfully carried out in the world (Nature369:533- 538, 1994). Kaushansky, TPO, CMK differentiation inducers were identified as potent differentiation inducers for TPO initiation (Nature369:568- 571, 1994). This study is aimed at analyzing the changes in the activity of c-mpl mRNA and c-mpl protein during differentiation and maturation of CMK cells, the changes in the receptor development mechanism during differentiation and induction of TPO, and the changes in the morphology during differentiation and maturation of megakaryocytes. 1)The expression of c-Mpl on the surface of megakaryocytes was characterized by time-dependent changes in the expression status of c-Mpl. FACS analysis was very difficult. The only antibody to c-Mpl was obtained from ZYMOGENETICS in the United States. The expression of c-Mpl on CMK cell surface was analyzed by FACS after differentiation and induction of TPO. 3 hours after TPO processing, c-Mpl[TPO receptor] will be identified as the largest and most likely to be lost after TPO processing. 2) The FACS analysis and analysis of TPO treatment under the same conditions showed that the c-Mpl expression status was changed in time, and the c-Mpl antibody of TPO treatment in China was changed in time. Now, the immunoprecipitation method is used to analyze the possible c-Mpl antibody in particular and to quantify the number of TPO receptors when TPO differentiation is induced. 3)In particular, the differentiation induction of CMK cells by TPO is related to the time-dependent changes in c-mpl gene expression activity of CMK cells during differentiation induction of TPO. The c-mpl gene expression activity of CMK cells during differentiation induction of TPO is related to the time-dependent changes in c-mpl gene expression activity of CMK cells during differentiation induction of TPO. The activity of TPO before treatment was confirmed.