ディファレンシャルディスプレー法を用いたブレオマイシン肺線維症の分子機構の解明

差异显示法阐明博来霉素肺纤维化的分子机制

• 批准号: 10771291
• 负责人: 熊谷 孝則
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771291/
• 关键词: ブレオマイシン; Differential Display; 半定量RT-PCR; 細胞周期; 遺伝子発現

ブレオマイシン(Bm)は、扁平上皮癌・精巣癌などに用いられる重要な抗癌剤であるが、長期投与により肺線維症と呼ばれる重篤な副作用を引き起こし易い。本研究では、肺正常繊維芽細胞株WI-38を用い、Bm投与時に引き起こされる遺伝子発現の変化をDifferential Display(DD)法により解析し、肺線維症の分子メカニズムの解明を目的とした。【方法】Bm投与・非投与のWI-38細胞からtotal RNAを抽出し、DD法を用いてBmにより誘導される遺伝子を検出した。さらに、半定量RT-PCRにより、誘導される遺伝子の発現状況を経時的に調べた。【結果】DD法の結果、Bm投与により誘導される遺伝子が多数見い出された(数十種)。それら遺伝子について、DNA塩基配列を決定し、ホモロジー解析を行ったところ、p21,proliferating cell nuclear antigen(PCNA)など、細胞周期に関連する遺伝子であることが判明した。これらの遺伝子およびその関連遺伝子(p53,ki-67 antigenなど)について、半定量のRT-RCRを用いてBm投与後の経時的な発現を調べたところ、p21およびPCNAはその発現が上昇し、ki-67 antigenは減少していた。また、Bm投与したWI-38細胞をローダミン・ファロイジン染色したところ、ストレスファイバーの消失が認められた。これらの結果から、細胞はBmによるDNA損傷を修復するための応答を行い、細胞周期の停止を引き起こすものと思われた。今後は、さらにDD法を行い、Bm肺線維症に関わる遺伝子を取得し、その分子機構を解明したいと考えている。

ブ レ オ マ イ シ ン は (Bm), squamous cell carcinoma, fine 巣 な ど に with い ら れ る important な anti-cancer tonic で あ る が, long-term investment and に よ り lung line d disease と shout ば れ る heavy Benedict を lead き な side effects on こ し い easily. This study で は normal 繊 d, lung bud cell lines WI - 38 を USES い, Bm and に lead き up こ さ れ る posthumous son 伝 発 の now - the を Differential Display (DD) method に よ り parsing し, lung line d の molecular メ カ ニ ズ ム の interpret を purpose と し た. 【 method 】 Bm, and the shots and の WI - 38 cells か ら を total RNA extraction し, DD を with い て Bm に よ り induced さ れ る heritage 伝 son を 検 out し た. Youdaoplaceholder0, semi-quantitative RT-PCRによ によ, and に regulation of the occurrence status of される residual 伝 samples を over time べた. 【 Result 】 The <s:1> results of the DD method, the Bm throw and the される induced by によ によ mostly leave 伝 offspring が, which can be found in the された output された(dozens). そ れ ら posthumous son 伝 に つ い て, DNA salt base with を decided し, ホ モ ロ ジ ー parsing line を っ た と こ ろ, p21, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) な ど, cell cycle に masato even す る posthumous son 伝 で あ る こ と が.at し た. こ れ ら の posthumous son 伝 お よ び そ の masato even heritage 伝 child (p53, ki - 67 antigen な ど) に つ い て, semi-quantitative の RT - RCR を with い て Bm after VCS and の 経 when な 発 now を adjustable べ た と こ ろ, p21 お よ び PCNA は そ の 発 now rising が し, ki - 67 antigen は reduce し て い た. ま た, Bm cast and し た WI - 38 cells を ロ ー ダ ミ ン · フ ァ ロ イ ジ ン dyeing し た と こ ろ, ス ト レ ス フ ァ イ バ ー の disappear が recognize め ら れ た. こ れ ら の results か ら, cell は Bm に よ る を DNA damage repair す る た め の 応 answer を い, cell cycle の stopped を lead き こ す も の と think わ れ た. Future は, さ ら に DD line method を い, Bm lung line d に masato わ る heritage 伝 child obtain を し, そ の molecular institutions を interpret し た い と exam え て い る.

项目成果

Kumagai,T.: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of bleomycin-binding protein from bleomycin-producing Streptomyces verticillus" Acta Crystallographica Section D. 54. 127-128 (1998)

Kumagai,T.：“产博来霉素链霉菌的博来霉素结合蛋白的结晶和初步 X 射线衍射研究”《结晶学报》第 D. 54. 127-128 部分 (1998)

Kumagai,T.: "Crystallization and Preliminary X-ray diffraction studies of bleomycin-binding protein encoded on the transposon Tn5" Acta Crystallographica Section D,. in press.

Kumagai,T.：“转座子 Tn5 上编码的博莱霉素结合蛋白的结晶和初步 X 射线衍射研究”《结晶学报》第 D 部分，。

Sugiyama,M.: "A mammalian vector carrying the bleomycin N-acetyltransferase gene from Streptomyces verticillus as a selective marker"Journal of Antibiotics. 52. 895-899 (1999)

Sugiyama，M.：“一种携带来自轮生链霉菌的博莱霉素 N-乙酰转移酶基因作为选择标记的哺乳动物载体”《抗生素杂志》。

Kumagai,T.: "Protection of mammalian cells from the toxicity of bleomycin by expression of a bleomycin-binding protein gene from Streptomyces verticillus" Journal of Biochemistry. 124. 835-841 (1998)

Kumagai,T.：“通过表达来自轮生链霉菌的博莱霉素结合蛋白基因，保护哺乳动物细胞免受博来霉素的毒性”《生物化学杂志》。

Kumagai,T.: "Mutation of the N-terminal proline 9 of BLMA from Streptomyces verticillus abolishes the binding affinity for bleomycin"FEBS Letters. 450. 227-230 (1999)

Kumagai,T.：“来自轮生链霉菌的 BLMA N 端脯氨酸 9 的突变消除了对博莱霉素的结合亲和力”FEBS Letters。