インフルエンザウイルスPA,PB2蛋白の立体構造解明と阻害剤の開発

流感病毒PA和PB2蛋白三维结构的阐明及抑制剂的开发

• 批准号: 11770163
• 负责人: 原 好勇
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kurume University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770163/
• 关键词: インフルエンザウイルス; RNAポリメラーゼ; PAサブユニット; プロテアーゼ; 立体構造

1.前年度では、精製したインフルエンザウイルスRNAポリメラーゼPAサブユニットがペプチド基質およびタンパク質を分解することを見出した。そして、DFPがPAとクロスリンクしたことからキモトリプシン様セリンプロテアーゼであることが分かった。今年度は、さらにプロテアーゼ活性部位の同定を行った。DFPのクロスリンクしたアミノ酸を調べた結果、DFPは、PAのSer616とSer624にクロスリンクしていた。このことから、セリンプロテアーゼの活性中心はこの部位に存在すると考えられた。2.さらにどちらのアミノ酸が活性部位であるかを同定するため、この2ヶ所のアミノ酸をトレオニンに置換した変異体、また欠損させた変異体を作成し、各変異体のPA蛋白の精製を行った。その結果、Ser616を変異してもプロテアーゼ活性が検出され〓のに対し、Ser624を変異あるいは欠失させると、活性は検出されなかった。この結果から、PAのセリンプロテアーゼ活性の〓心はSer624であることが分かった。3.以上、精製したPAはペプチド基質およびタンパク質を分解すること、ウイルス粒子内PAにも同様の活性がみられること、活性中心を他のアミノ酸に置換または欠損させると活性が消失すること、などからPAはプロテアーゼ活性をもつことを証明した。PAプロテアーゼ活性はRNAポリメラーゼからは初めての例であり、PAは遺伝子の複製およびタンパク分解の二つの機能をもつことになる。今後、遺伝子の転写・複製機構にプロテアーゼの関与する新たな側面が展開されるものと考えられる。4.現在、PAプロテアーゼ活性部位の立体構造を解明するため、その結晶化に取り組んでいる。

1 year before で は, refined し た イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス RNA ポ リ メ ラ ー ゼ PA サ ブ ユ ニ ッ ト が ペ プ チ ド matrix お よ び タ ン パ ク qualitative を decomposition す る こ と を see out し た. そ し て, DFP が PA と ク ロ ス リ ン ク し た こ と か ら キ モ ト リ プ シ ン others セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ で あ る こ と が points か っ た. This year, the active sites of さらにプロテア and さらにプロテア ゼ are determined to be を rows った. DFP の ク ロ ス リ ン ク し た ア ミ ノ acid を adjustable べ た results, DFP は, PA の Ser616 と Ser624 に ク ロ ス リ ン ク し て い た. There is a すると study of えられた in the に active center と ら ら and セリ プロテア プロテア ゼ ゼ ゼ of the <s:1> active center に えられた えられた site. 2. さ ら に ど ち ら の ア ミ ノ acid が active site で あ る か を with fixed す る た め, こ の 2 ヶ の ア ミ ノ acid を ト レ オ ニ ン に replacement し た - variants, ま た owe loss さ せ た - variant を make し, each 1 - line の PA protein の refined を っ た. そ の results, Ser616 を - different し て も プ ロ テ ア ー ゼ active が 検 out さ れ 〓 の に し, seaborne Ser624 を - different あ る い は owe lost さ せ る と, active は 検 out さ れ な か っ た. The <s:1> <s:1> results showed that the ゼ ら and PA <s:1> セリ プロテア プロテア ゼ ゼ ゼ active center <s:1> Ser624である とが とが とが scores were とが った. 3. Above, refined し た PA は ペ プ チ ド matrix お よ び タ ン パ ク qualitative を decomposition す る こ と, ウ イ ル ス particles within the PA に も with others の active が み ら れ る こ と, active center を he の ア ミ ノ acid に replacement ま た は owe loss さ せ る が と disappeared す る こ と, な ど か ら PA は プ ロ テ ア ー ゼ active を も つ こ と を prove し た. PA プ ロ テ ア ー ゼ は active RNA ポ リ メ ラ ー ゼ か ら は early め て の example で あ り, PA は posthumous son 伝 の copy お よ び タ ン パ ク decomposition の two つ の function を も つ こ と に な る. In the future, but 伝 の planning, write copy, institutions に プ ロ テ ア ー ゼ の masato and す る new た な side が expand さ れ る も の と exam え ら れ る. 4. Now, the <s:1> three-dimensional structure of the active site of PAプロテア ゼ ゼ is を clarified するため and そ <s:1> crystallized に. Take the group んで る る る る.

项目成果

豊田哲也・原 好勇: "インフルエンザウイルスの分子生物学4 ・感染分子機構からみた治療薬開発の方向性"治療学. 34. 44-49 (2000)

Tetsuya Toyota 和 Yoshiyu Hara：“流感病毒的分子生物学 4 - 从感染分子机制的角度研究治疗药物的开发方向” Therapeutics. 34. 44-49 (2000)。

Toyoda T.,Ohtsu Y.,Hara K.,Masunaga K.,Hamada N.,Koga M.,Kashiwagi T.and Iwahashi J.: "Molecular dissection of influenza virus RNA polymerase"Rec.Res.Dev.Virol.. 1(印刷中). (1999)

Toyoda T.、Ohtsu Y.、Hara K.、Masunaga K.、Hamada N.、Koga M.、Kashiwagi T. 和 Iwahashi J.：“流感病毒 RNA 聚合酶的分子解剖”Rec.Res.Dev.Virol.. 1（正在出版）（1999）。

Kashiwagi T.,Hamada N.,Iwahashi J.,Hara K.,Ueda T.,Noguchi H.,and Toyoda T.: "Emergence of new influenza A viruses which carry an escape mutation of the HLA-B27-restricted CTL epitope of NP in Japan"Microbiol.Immunol.. 44. 867-870 (2000)

Kashiwagi T.、Hamada N.、Iwahashi J.、Hara K.、Ueda T.、Noguchi H. 和 Toyoda T.：“携带 HLA-B27 限制性 CTL 表位逃逸突变的新型甲型流感病毒的出现

Hara K.,Shiota M.,Kido H.,Ohtsu Y.,Kashiwagi T.,Iwahashi J.,Hamada N.,Mizoue K.,Tsumura N.,Kato H.and Toyoda T.: "Influenza virus RNA polymerase PA subunit is a novel serine protease with Ser624 in the active site"Genes to Cells. 6. 87-98 (2001)

Hara K.、Shiota M.、Kido H.、Ohtsu Y.、Kashiwagi T.、Iwahashi J.、Hamada N.、Mizoue K.、Tsumura N.、Kato H. 和 Toyoda T.：“流感病毒 RNA 聚合酶 PA

Hara K.,Kido H.,and Toyoda T.: "Protease activity of influenza virus RNA polymerase PA subunit."In'Options for the control of influenza IV', ICS 1219 (Albert D. M. E. Osterhaus, et al. eds.), Elsevier, Amsterdam. (in press). (2001)

Hara K.、Kido H. 和 Toyoda T.：“流感病毒 RNA 聚合酶 PA 亚基的蛋白酶活性”。“控制流感 IV 的选项”，ICS 1219（Albert D. M. E. Osterhaus 等编辑），