新たに発見したPAプロテアーゼを標的とした抗インフルエンザウイルス薬の開発

开发针对新发现的PA蛋白酶的抗流感病毒药物

基本信息

  • 批准号:
    14021127
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.92万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 财政年份:
    2002
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2002 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

インフルエンザウイルスRNAポリメラーゼ・PAサブユニットに存在するプロテアーゼ活性が、ウイルス複製にどのような役割を果たしているか、また新規抗インフルエンザウイルス薬の標的となりえるかについて検討した。本年度はPAのプロテアーゼ活性部位を欠失したノックアウトウイルス「S624A」を作製し、培養細胞系でのウイルス増殖能およびマウスに対する病原性について調べた。1)S624Aの培養細胞における増殖能についてインフルエンザウイルスWSN株(H1N1)のPAプロテアーゼ活性部位であるセリンをアラニンに置換した変異ウイルス「S624A」を、リバースジェネティクス法により作製した(Brownlee G. G. et al.,Oxford Univ.との共同研究)。これを、MDBK細胞に接種し培養したところ、CPEの進行がWTより少し遅れる傾向を示し、またウイルスの増殖レベルはWTより常に2〜4倍低い値を示した。一方、ウイルス増殖の安定性を調べるため、ウイルスの継代をMDBK細胞で繰り返してみたところ、不完全ウイルス粒子の産生はみられなかった。2)S624Aの遺伝子の転写・複製能についてインフルエンザウイルスRNAポリメラーゼの転写活性を定量化するため、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとしてNS遺伝子内に挿入し、これをPB1、PB2、PA、NPと同時に発現させ、ルシフェラーゼの発現量により転写活性を測定した。その結果、PAプロテアーゼ活性部位を別のアミノ酸(S624A)に置換しても転写活性に影響は見られなかった。また、mRNA、cRNA、vRNAの合成量についても影響はみられなかった。3)S624Aのマウスに対する病原性についてS624Aをマウスに経鼻接種し、個体レベルでのS624Aの増殖能および病原性について検討した。その結果、S624Aの病原性はWTと比較して若干低下する傾向がみられた(S624A; LD_<50>=10^<4.6>PFU、WT; LD_<50>=10^<4.0>)。また、マウス肺におけるウイルス増殖能にも若干の低下が見られた。以上の結果から、PAのプロテアーゼ活性はウイルス増殖に必須ではないが、ウイルス増殖を最大限に引き出すために必要な活性であることが示唆された。
In addition to the above, it is also possible to modify the structure of the system by modifying the structure of the system. This year, the active site of PA was not detected, and S624A was used to control and culture cell lines. 1) S624A cultured cells can be cultured in the presence of PA-containing active sites of WSN strain (H1N1), and the growth and development of PA-containing active sites of WSN strain (H1N1) can be controlled by the method of "S624A"(Brownlee G. G. et al., Oxford Univ.(joint study). The growth of MDBK cells in culture was 2 - 4 fold lower than that of CPE. The stability of MDBK cells is regulated, and the generation of MDBK cells is not complete. 2) Quantification of the transcription activity of the S624A gene and its replication ability. Determination of the transcription activity of the S624A gene and its replication ability. As a result, PA has been found to be active at different sites, such as acid (S624A), and the effect of substitution on activity has been observed. The synthesis of mRNA, cRNA and vRNA is affected by the changes in the synthesis of mRNA, cRNA and vRNA 3) S624A can be used to detect the pathogenicity of S624A. S624A can be used to detect the pathogenicity of S624A. As a result, the pathogenicity of S624A was lower than WT (S624A; LD_<50>=10^<4.6>PFU, WT; LD_<50>=10^<4.0>). It's not easy to find a way out. The above results show that PA activity is necessary for its growth, and its maximum growth is necessary for its growth.

项目成果

期刊论文数量(12)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Hara K., Shiota M., Kido H., Oht su Y., Kashiwagi T., Iwahashi J., Hamada N., Mizoue K., Tsumura N., Kato H., Toyoda T.: "Influenza virus RNA polymerase PA subunit is a novel serine protease with Ser624 in the active site"Genes to Cells. 6. 87-97 (2001)
Hara K.、Shiota M.、Kido H.、Oht su Y.、Kashiwagi T.、Iwahashi J.、Hamada N.、Mizoue K.、Tsumura N.、Kato H.、Toyoda T.:“流感病毒 RNA 聚合酶
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
豊田哲也, 原 好勇: "インフルエンザウイルスの構造と遺伝子"臨床検査. 46. 133-138 (2002)
Tetsuya Toyota、Yoshiyu Hara:“流感病毒的结构和基因”临床测试 46. 133-138 (2002)。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Hara K., Kido H., Toyoda T.: "Protease activity of influenza virus RNA polymerase PA subunit"In 'Options of the control of influenza IV', ICS 1219 (Albert D. M. E. Osterhaus, et al. eds.), Elsevier, Amsterdam. 1219. 479-485 (2001)
Hara K.、Kido H.、Toyoda T.:“流感病毒 RNA 聚合酶 PA 亚基的蛋白酶活性”在“IV 型流感控制选项”中,ICS 1219(Albert D.M.E.Osterhaus 等编辑),Elsevier,
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
原好勇,豊田哲也: "抗インフルエンザウイルス薬"治療学. 34. 981-986 (2000)
Yoshiyu Hara,Tetsuya Toyota:“抗流感病毒药物”Therapeutics. 34. 981-986 (2000)。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
豊田哲也,原好勇: "インフルエンザウイルスの分子生物学4・感染分子機構からみた治療薬開発の方向性"治療学. 34. 44-49 (2000)
Tetsuya Toyota、Yoshiyu Hara:“流感病毒的分子生物学4:从感染分子机制角度的治疗药物开发方向” Therapeutics. 34. 44-49 (2000)。
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  • 发表时间:
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  • 作者:
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  • 通讯作者:
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  • DOI:
  • 发表时间:
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  • 作者:
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  • 通讯作者:
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  • DOI:
  • 发表时间:
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  • 作者:
    柏木 孝仁;原 好勇;上村 勇作;今村 宜寛;濱田 信之;渡邊 浩
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