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血管内皮機能不全に対する遺伝子治療法の確立

血管内皮功能障碍基因治疗的建立

基本信息

批准号：
12770375
负责人：
筒井正人
金额：
$ 1.66万
依托单位：
University of Occupational and Environmental Health, Japan
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

1.組換えアデノウイルスベクターの作製Harvard大学Eva J, Neerから供与されたGiα-2coding region cDNAを、コスミドベクター(pAxCAwt)に組み込んだ。発現の強いGiα-2コスミドベクタークローンを用いて、COS-TPC法によりアデノウイルスゲノムDNAとの相同組換えを行った。制限酵素処理による構造解析では、正しい塩基配列を示した。2.ベクターによるGiα-2蛋白過剰発現の確認作製した組換えアデノウイルスベクターを用いてECV304細胞に遺伝子導入を行うと、Giα-2蛋白が時間依存的に過剰発現することをWestern blot解析によって確認した。3.高力価ベクターの調製293細胞を用いて高力価ベクターの大量調製を行った。プラーク形成法による最終的なベクターの力価は10^<10>pfu/mlであった。4.ブタバルーン傷害冠動脈の再生内皮に対するex vivo遺伝子導入ブタ冠動脈をバルーンで傷害し、4週間後に冠動脈を単離した。血管輪をベクターに30分間暴露させた後、CO_2インキュベーターで培養し、24時間後にorgan chamber装置で等尺性張力を測定した。バルーン傷害冠動脈では対照(非傷害)冠動脈と比較してα_2刺激薬UK14304及びセロトニンによるGi蛋白を介した内皮依存性弛緩反応が選択的に減弱していたが、Giα-2蛋白遺伝子導入を行うと、予備的な結果では、同反応が改善する傾向を示した。現在、NO産生能に及ぼす影響も含めて、さらなる検討を行っている。以上のように、293細胞を用いた相同組換えにより、Gi蛋白cDNA(Giα-2)を組み込んだアデノウイルスベクターを完成させた。

1. Construction of the Giα-2 coding region cDNA (pAxCAwt) by Eva J, Neer, Harvard University The discovery of strong Giα-2 The structure analysis of restriction enzyme processing is shown in the following ways: 2. Western blot analysis confirmed the time-dependent expression of Giα-2 protein in ECV304 cells. 3. High power modulation 293 cells are used in high power modulation The final strength of the formation method is 10^<10>pfu/ml. 4. The ex vivo gene was introduced into the injured coronary artery and the coronary artery was isolated after 4 weeks. After 30 minutes of exposure to CO_2, isostatic tension was measured in organ chamber after 24 hours of incubation. Compared with the contralateral (non-contralateral) coronary artery, there was a tendency for Gi α-2 protein expression to decrease in endothelium-dependent relaxation response mediated by α-2 stimulation and Giα-2 protein expression to improve in comparison with the contralateral (non-contralateral) coronary artery. Now, NO can be produced and the effects of NO can be discussed. The above two cells were used in the same way: Gi protein cDNA (Gi α-2) and Gi protein cDNA(Giα-2).