ヒト血液細胞におけるcAMP応答エレメント結合蛋白の役割

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研究代表者は、ヒト血液細胞において転写因子cAMP応答エレメント結合蛋白(CREB)を遺伝子導入により過剰発現させた際にアポトーシスが誘導されることを観察した。平成12年度にはこの分子機序を明らかにするためにCREBの変異体解析を行った。その結果、アポトーシス誘導にはCREBの転写活性化ドメインおよびリン酸化酵素誘導性ドメインは必要なく、DNA結合ドメインおよびそのN末に隣接するわずか4つの酸性アミノ酸からなる領域が必要であることが明らかになった。平成13年度には、アポトーシス誘導における上記の4つのアミノ酸(テトラペプチド)の構造の意義を明らかにするために、これに結合する細胞性因子の単離・精製を行った。具体的には、上記の4つの酸性アミノ酸からなる合成テトラペプチドにビオチンを付加したプローブを作製し、血液細胞の核溶解液と混合して反応させ、テトラペプチドに結合した核内因子をアビジンビーズにより沈降させた(結合特異性は非ビオチン化ペプチドによる結合の競合阻害により確認した)。得られた沈降産物をSDS-PAGE法により分離した後に銀染色を施したところ50kDの蛋白分子が可視化された。この因子のアミノ酸の一次構造を解析するために、ゲルより溶出してエンドペプチダーゼ処理を施してから質量分析を行い既存のデータベースと照合したところ翻訳伸長因子Elongation factor-1α(EF-1α)であることが判明した。さらに細胞内で実際にCREBとEF-1αが結合していることも、細胞核溶解液を抗CREB抗体で免疫沈降したものへの抗EF-1α抗体によるウエスタンブロット、細胞核溶解液を抗EF-1α抗体で免疫沈降したものへの抗CREB抗体によるウエスタンブロットにより確認された。今後はCREBによるアポトーシス誘導におけるEH-1αの意義について検討を進めていく予定である。