ヒト血液細胞におけるcAMP応答エレメント結合蛋白の役割

cAMP反应元件结合蛋白在人血细胞中的作用

• 批准号: 12770577
• 负责人: 佐伯 久美子
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Research Institute, International Medical Center of Japan
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770577/
• 关键词: CREB; アポトーシス; 遺伝子導入; テトラペプチド; DNAドメイン; 酸性アミノ酸; 翻訳伸長因子; 質量分析; 遺伝子導入法; 誘導的遺伝子発現システム; DNA結合ドメイン

研究代表者は、ヒト血液細胞において転写因子cAMP応答エレメント結合蛋白(CREB)を遺伝子導入により過剰発現させた際にアポトーシスが誘導されることを観察した。平成12年度にはこの分子機序を明らかにするためにCREBの変異体解析を行った。その結果、アポトーシス誘導にはCREBの転写活性化ドメインおよびリン酸化酵素誘導性ドメインは必要なく、DNA結合ドメインおよびそのN末に隣接するわずか4つの酸性アミノ酸からなる領域が必要であることが明らかになった。平成13年度には、アポトーシス誘導における上記の4つのアミノ酸(テトラペプチド)の構造の意義を明らかにするために、これに結合する細胞性因子の単離・精製を行った。具体的には、上記の4つの酸性アミノ酸からなる合成テトラペプチドにビオチンを付加したプローブを作製し、血液細胞の核溶解液と混合して反応させ、テトラペプチドに結合した核内因子をアビジンビーズにより沈降させた(結合特異性は非ビオチン化ペプチドによる結合の競合阻害により確認した)。得られた沈降産物をSDS-PAGE法により分離した後に銀染色を施したところ50kDの蛋白分子が可視化された。この因子のアミノ酸の一次構造を解析するために、ゲルより溶出してエンドペプチダーゼ処理を施してから質量分析を行い既存のデータベースと照合したところ翻訳伸長因子Elongation factor-1α(EF-1α)であることが判明した。さらに細胞内で実際にCREBとEF-1αが結合していることも、細胞核溶解液を抗CREB抗体で免疫沈降したものへの抗EF-1α抗体によるウエスタンブロット、細胞核溶解液を抗EF-1α抗体で免疫沈降したものへの抗CREB抗体によるウエスタンブロットにより確認された。今後はCREBによるアポトーシス誘導におけるEH-1αの意義について検討を進めていく予定である。

Research representatives は, ヒ ト blood cells に お い て planning write factor cAMP 応 answer エ レ メ ン ト binding protein (after CREB) を heritage 伝 son import に よ り through turning 発 now さ せ た interstate に ア ポ ト ー シ ス が induced さ れ る こ と を 観 examine し た. In the Heisei 12 year, the sequence of に, ら, and <s:1> molecular mechanisms を was revealed in ら, にするために, and the analysis of CREB <s:1> variants was conducted in を rows った. そ の results, ア ポ ト ー シ ス induced に は after CREB の planning write activeness ド メ イ ン お よ び リ ン acidification enzyme induced ド メ イ ン は necessary な く, DNA binding ド メ イ ン お よ び そ の N at the end of the に 隣 meet す る わ ず か 4 つ の acid ア ミ ノ acid か ら な が る field necessary で あ る こ と が Ming ら か に な っ た. Pp.47-53 13 year に は, ア ポ ト ー シ ス induced に お け る written の 4 つ の ア ミ ノ acid (テ ト ラ ペ プ チ ド) の tectonic significance の を Ming ら か に す る た め に, こ れ に combining す る cell sex factor の 単 away from the line, the refined を っ た. Specific に は, written の 4 つ の acid ア ミ ノ acid か ら な る synthetic テ ト ラ ペ プ チ ド に ビ オ チ ン を plus し た プ ロ ー ブ を cropping し, blood cell の karyolysis と mixed し て anti 応 さ せ, テ ト ラ ペ プ チ ド に combining し た nuclear factor within を ア ビ ジ ン ビ ー ズ に よ り sink さ せ た (combined with specific は non ビ オ チ ン change ペ プ チ ド に よ Youdaoplaceholder0, in combination with <s:1> competitive and cooperative hindrance によ によ によ confirm that た). Have ら れ た sink product を sds-page method に よ り separation し た に after silver staining を shi し た と こ ろ 50 kd の protein molecule が visualization さ れ た. こ の factor の ア ミ ノ acid の a tectonic analytical す を る た め に, ゲ ル よ り dissolution し て エ ン ド ペ プ チ ダ ー ゼ 処 Richard を shi し て か ら line quality analysis を い existing の デ ー タ ベ ー ス と as close し た と こ ろ turn 訳 Elongation Elongation factor alpha factor - 1 (alpha) EF - 1 で あ る こ と が.at し た. で さ ら に cell be interstate に after CREB と EF - 1 alpha が combining し て い る こ と も, nucleus dissolved liquid を で after CREB antibody immune resistance sink し た も の へ の EF - 1 alpha antibody resistance に よ る ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト, nucleus dissolved liquid を で EF - 1 alpha antibody immune resistance sink し た も の へ の resistance after CREB antibody に よ る ウ エ ス タ ン ブ ロ Youdaoplaceholder0 ットによ confirm された. Future は after CREB に よ る ア ポ ト ー シ ス induced に お け る EH - 1 alpha の meaning に つ い て beg を 検 into め て い く designated で あ る.

项目成果

Saeki K, Yuo A, Koizumi M, Fujiwara K, Kaneko M, Takaku F, Yazaki Y.: "CREB antisense oligonucleotides induce non-apoptotic cell death in proliferating leukemia. cells, but not normal hematopoietic cells, by a bizarre non-antisense mechanism"Leukemia. 15.

Saeki K、Yuo A、Koizumi M、Fujiwara K、Kaneko M、Takaku F、Yazaki Y.：“CREB ​​反义寡核苷酸在增殖性白血病中诱导非凋亡细胞死亡。细胞，但不是正常造血细胞，通过一种奇怪的非反义

Saeki K et al: "Bcl-2 down-regulation causes autophagy"Cell Death Diff. 7. 1263-1269 (2000)

Saeki K 等人：“Bcl-2 下调导致自噬”细胞死亡差异。

Saeki K et al: "CREB antisense digonucleotides"Leukemia. 15. 238-245 (2001)

Saeki K等人：“CREB反义二聚核苷酸”白血病。

Belmonte N, Phillips BW, Massiera F, Villageois P, Wdziekonski B, Saint-Marc P, Nichols J, Aubert J, Saeki K, Yuo A, Narumiya S, Ailhaud G, Dani C: "Activation of Extracellular Signal-Regulated Kinases and CREB/ATF-1 Mediate the Expression of CCAAT/Enhanc

Belmonte N、Phillips BW、Massiera F、Villageois P、Wdziekonski B、Saint-Marc P、Nichols J、Aubert J、Saeki K、Yuo A、Narumiya S、Ailhaud G、Dani C：“细胞外信号调节激酶的激活和

Saeki K, Yuo A, Takaku F: "Cell-cycle-regulated phosphorylation of cAMP response element-binding protein : identification of novel phosphorylation sites"Biochemical Journal. 338. 49-54 (1999)

Saeki K、Yuo A、Takaku F：“cAMP 反应元件结合蛋白的细胞周期调节磷酸化：新磷酸化位点的鉴定”生物化学杂志。