ln-Cell NMR:細胞内蛋白質間相互作用の直接解析法の開発

细胞内核磁共振：开发直接分析细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的方法

• 批准号: 15657031
• 负责人: 伊藤 隆
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan University (2005)The Institute of Physical and Chemical Research (2003-2004)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15657031/
• 关键词: In-Cell NMR; 生細胞; 蛋白質間相互作用; 安定同位体標識; 高分解能; 非破壊性; 非線形サンプリング; 異種核多次元NMR

本研究の目的は,In-Cell NMRの手法を用いて,生細胞中の蛋白質間相互作用を直接観測するシステムを確立するというものである.平成17年度は平成16年度までの結果を基にして以下のポイントについて開発研究を行った.1.^<13>C/^<15>N二重標識を用いたIn-Cell NMRシグナルの帰属法の検討細胞内蛋白質の動態を解析するためには,In-Cell NMRを用いてシグナルの位置特異的帰属を行っていく必要がある.一方で平成16年度までの研究から,In-Cell NMR測定では,(1)細胞中の目的蛋白質の寿命が短い,(2)細胞中の蛋白質濃度が低いため感度が低い,(3)細胞中の粘性などの影響でシグナルの線幅が著しく増大する,などの問題点が明らかになっていた.平成17年度は,これらの問題を解決するために,異種核多次元NMRを短時間で感度よく測定する手法の確立を行った.具体的には,非線形サンプリング法で測定したデータを最大エントロピー法を用いて処理を行なうことで,数時間で十分な感度と分解能を持つ3次元In-Cell NMRスペクトルを得ることに成功した.この手法を用いることで,生きた大腸菌中のCalmodulin(14kDa),およびCalmodulinのN末端およびC末端ドメインについて,主鎖NMRシグナルの帰属を行なうことができた.またこの手法は,In-Cell NMRのみならず,これまで解析の困難であった,溶解度が低く不安定な蛋白質の解析にも極めて有用であることを示した.2.In-Cell NMRを用いた蛋白質間相互作用の解析の試みIn-Cell NMR法を発展させることで,細胞内の蛋白質間互作用を従来法より高分解能で観測できる手法となる可能性がある.CalmodulinおよびCalmodulinと相互作用する蛋白質の大腸菌内共発現系を構築し,細胞内での蛋白質間相互作用の解析を行なった.

这项研究的目的是建立一个直接使用细胞内NMR技术在活细胞中蛋白质 - 蛋白质相互作用的系统。 2005年，我们根据2004.1的结果对以下几点进行了开发研究。使用双重标记来检查用于分析细胞内蛋白的动力学的分配方法，用于分析细胞内蛋白的动力学，必须使用内部NMR进行特定于位置的信号分配。另一方面，从研究到2004年，我们发现NMR是截至2004年的研究的结果。NMR测量结果揭示了诸如（1）细胞中靶蛋白的寿命，（2）由于细胞中的蛋白质浓度较低，敏感性较低，并且信号线宽度可显着增加，并且（3）对这些细胞的效果显着增加了，而构成的效果则是繁殖的。建立了一种在短时间内测量异源核多维NMR的方法。具体而言，通过使用最大熵方法来处理通过非线性采样测量的数据，我们成功获得了3D内NMR频谱，并在几个小时内具有足够的灵敏度和分辨率。使用这种方法，我们能够将主链NMR信号分配给钙调蛋白（14KDA）和钙调蛋白的N末端和C末端结构域。此外，该方法用于将主链NMR信号分配给内部的N末端和C末端域。它表明，它不仅对NMR非常有用，而且对于溶解度较低且不稳定的蛋白质的分析非常有用，直到现在一直很难分析。2。试图通过开发细胞内NMR方法来使用细胞内NMR分析蛋白质 - 蛋白质相互作用，此方法可能会观察到具有比常规方法更高分辨率的细胞内解释蛋白相互作用。我们构建了一种与钙调蛋白和钙调蛋白相互作用的蛋白质共表达系统，并分析了细胞内解释蛋白相互作用。

项目成果

生命秩序を担う生体超分子 蛋白質・核酸・酵素 2005年8月号増刊

负责生命秩序的生物超分子：蛋白质、核酸和酶 2005 年 8 月特别版

• 发表时间: 2005
• 作者: M.Itoh;K.Nagatomo;Y.Kubo;Y.Sugimoto;O.Saitoh;M.Watanabe;Kaori Kurashima-Ito;Yasuhiro Isogai;Sundaresan Rajesh;伊藤 隆(共著);伊藤 隆(共著)
• 通讯作者: 伊藤 隆(共著)

Heteronuclear multidimensional NMR and homology modelling studies of the C-terminal nucleotide-binding domain of the human mitochondrial ABC transporter ABCB6

人线粒体 ABC 转运蛋白 ABCB6 C 端核苷酸结合域的异核多维 NMR 和同源建模研究

• 发表时间: 2006
• 期刊: Journal of Biomolecular NMR (印刷中)
• 作者: M.Itoh;K.Nagatomo;Y.Kubo;Y.Sugimoto;O.Saitoh;M.Watanabe;Kaori Kurashima-Ito
• 通讯作者: Kaori Kurashima-Ito

Solution structure of the C-terminal transcriptional activator domain of FixJ from Sinorhizobium meliloti and its recognition of the fixK promoter

• DOI: 10.1021/bi0509043
• 发表时间: 2005-11-15
• 期刊: BIOCHEMISTRY
• 影响因子: 2.9
• 作者: Kurashima-Ito, K;Kasai, Y;Shiro, Y
• 通讯作者: Shiro, Y