权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

ストレス応答のシステム生物学:出芽酵母GCN経路のリアルタイム計測

应激反应的系统生物学：酿酒酵母 GCN 通路的实时测量

基本信息

批准号：
16651095
负责人：
伊藤隆司
金额：
$ 1.98万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16651095/
关键词：
アミノ酸センサー FRET HisJ EYFP ECFP

项目摘要

本研究の目的は、ストレス応答のシステム生物学的解析への第一歩として、出芽酵母の栄養ストレス応答を制御するGCNパスウェイの挙動をリアルタイムに計測できる実験系を構築することにある。具体的には、GCN経路の出力である細胞質内のアミノ酸濃度の実時間計測を行なうことを目指して、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を利用したセンサーの開発に取り組んだ。センサーの骨格としては、大腸菌のペリプラズム結合蛋白質HisJを用いた。HisJは2つのローブからなる蛋白質で、ヒスチジンと結合すると、コンフォメーションの変化が起こり、ローブの位置関係が変化する。そこでN末とC末に黄色蛍光蛋白質YFPとシアン蛍光蛋白質CFPを付加しておくと、FRETの変化が起こると期待される。この考えに基づいて、YFP-HisJ-CFPを作成したところ、ヒスチジンの添加とともにFRETが減少してゆくセンサーを開発することに成功した。更に細胞質内のヒスチジン濃度に合致したKdを持つように変異を導入したところ、Glnに対しても親和性を持つことが判明した。そこで、ドッキングシミュレーションを用いてGlnの結合様式を予測し、それに基づく変異導入でGlnには殆ど結合せず、生理的な濃度のHisに応答できるセンサーの開発に成功した。このセンサーを用いて倍地中のHisの変化に応じた細胞質Hisの変化の計測に成功した。しかしながら、内因性の蛍光物質が培地中に蓄積することから、培養液そのものを用いた蛍光計測が困難である。現在、これを回避する為に励起-蛍光波長が長波長側にずれたセンサーの開発を試みている。

In this study, the purpose of this study is to respond to the analysis of biology. The first part of the study is that the budding yeast is responsible for the control of GCN infection. The specific data and GCN channels are used to analyze the temperature in the cell, and the data transfer (FRET) is used to access the data of the system. The protein HisJ was used in combination with the combination of bone marrow and fungus. HisJ