蛋白質間相互作用ドメインへのゲノム的アプローチ

蛋白质-蛋白质相互作用域的基因组方法

• 批准号: 12034207
• 负责人: 伊藤 隆司
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12034207/
• 关键词: 蛋白質相互作用; 酵母2ハイブリッド法; 相互作用ドメイン

我々は網羅的2ハイブリッド解析の成果に基づき、そこから相互ドメインを組織的にマッピングする目的で下記の「2ハイブリッドフットプリント法」(2HF)を考案した。まず標的ORFに一方向性に欠失を導入した変異体集団を活性化ドメイン融合ベクター(prey)上で構築、2ハイブリッド選択を行った選択集団と行わない非選択集団とを得る。続いて両集団全体からpreyのインサートをPCR増幅、電気泳動で展開する。非選択集団からは全長インサート断片以下レーン全体に渡るラダーが得られるが、選択集団からのラダーは結合領域の境界までで途切れる。これが2HFの原理である。2HFを行う際に最も問題となるのは、如何に簡便に一方向性に欠失変異を持ったDNA集団を得るかである。我々は組み換えを利用する新規のdeletion by recombination(DBR)法を考案した。DBRではまず標的ORFの例えばN末端部位で切断して得た線状プラスミドとその切断点に隣接するベクター由来の部分(活性化ドメインコード領域)のC末端側にランダム配列を付加した断片とを用意する。次に、両者を同時に酵母に形質転換すると、両者が共有する活性化ドメインコード領域でDNA鎖の乗り換えが起こり、更にランダム配列部分が切断点下流のプラスミド上のどこかと組み換わったプラスミド、つまり切断点と組み換え点の間が様々に欠失したプラスミド、を保持した酵母細胞集団が得られるはずである。このような発想の下、我々はモデル系でDBR現象を確認、更に基本反応条件を確立した。更に、DBRを酵母MAPKカスケードのスキャフォールド蛋白質STE5に実際に応用し、STE11、STE7結合部位の2HFマッピングに成功した。これにより2HFのfeasibilityが示され、その技術基盤が確立した。現在、実用化を目指して反応の至適化を進めている。

The results of our web site are analyzed in terms of the basis of the results, and the objectives of the organization are related to each other. The purpose of this paper is to review the "2-minute" (2HF) test. The direction of the ORF of the data sets is not available. The data sets are active. The fusion data sets (prey) are different from each other. The exhibition of prey swimming equipment and electrophoretic swimming equipment will be carried out in all parts of the world. The whole length of the non-elective collection is divided into the following segments, and the selection is combined with the realm of the field. The principle of the 2HF is very simple. 2HF is responsible for the most difficult problems, such as how to improve the directionality, and how to maintain the accuracy of the DNA set. We will make use of the new rules and regulations deletion by recombination (DBR) method to conduct an examination. The ORF example of DBR at the N-terminal is cut off and the cut-off point is connected to the origin part of the C-terminal section (the field of activation) the C-terminal segment is arranged to add the fragment meaning. In the second, the same time, there is a common activation system in the field of the DNA system, the user, the user, the operating point, the operating point, the location, the location, Keep the yeast cell collection in order to get the yeast cell population. I would like to make sure that the DBR is confirmed and that the basic counter-conditions are established. The combination of DBR yeast MAPK protein, STE11 protein and STE7 protein was successful in the combination of 2HF and 2HF. Make sure that the 2HF feasibility shows you that the technical basis is established. At present, the purpose of practical use is to make progress from the reverse to the current situation.

项目成果

Kubota,H. et al.: "Budding yeast GCN1 binds GI domain to activate the eIF2alpha kinase GCN2"J.Biol.Chem.. 276(in press). (2001)

久保田，H.

Ito,T. et al.: "A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 98(in press). (2001)

伊藤，T.

Ito,T. et al: "Toward a protein-protein interaction map of the budding yeast : a comprehensive system to examine two-hybrid interactions in all possible combinations between the yeast proteins"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97(3). 1143-1147 (2000)

伊藤，T.

Kubota,H. et al.: "GI domain-mediated association of the eukaryotic initiation factor 2_<alpha> kinase GCN2 with its activator GCN1 is required for general amino acid control in budding yeast"J.Biol.Chem.. 275(27). 20243-20246 (2000)

久保田，H.

Mizushima,K. et al.: "A novel G-protein coupled receptor gene expressed in striatum"Genomics. 69. 314-321 (2000)

水岛，K.