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エピジェネティクスの基本動作原理に基づくメチロームの合成

基于表观遗传学基本操作原理的甲基化组合成

基本信息

批准号：
22K19276
负责人：
伊藤隆司
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19276/
关键词：
ゲノム編集 DNAメチル化合成生物学酵母

项目摘要

出芽酵母ゲノム中にメチル化を導入（開始）し、拡張・制限・維持を行うのが本研究の挑戦である。これらを行うためのゲノム領域を出芽酵母ゲノム中に創出するために、λファージゲノム48.5 kbをそっくりそのままho遺伝子座位に挿入することを試みた。具体的には、Cas9によるゲノム編集によって、48.5 kbのλDNAを挿入しようとしたが、所期の成果を得られなかった。そこで48.5 kbを相互にオーバーラップした６つの断片に分けてPCRによって調製し、それらを同時にゲノム編集に用いることを試みた。当初、選択を容易にするべく栄養選択マーカーを持たせた形で実施して、６断片が想定された順番通りに挿入されたことを示す結果が得られた。更に、条件を最適化したところ、選択マーカーなしでのλDNAの挿入にも成功したことが示唆された。最終的には、ナノポアシーケンシングを行って、所期の通りにλDNAをゲノム中に挿入できたことを確認した。更に、導入したDNAメチル化の維持を行うために、維持メチル化酵素DNMT5の人工遺伝子の合成を行い、それらを発現する株の作成を進行中である。これらのゲノム改変を効率的に進めるために、以前に開発した遺伝子編集プラスミドシリーズを拡張し、３遺伝子座の同時編集も高い効率で進める系を確立した。

The introduction, expansion, restriction and maintenance of budding yeast are the challenges of this study. This is a 48.5 kb DNA fragment from the yeast genome. The specific Cas9 DNA sequence was compiled using 48.5 kb DNA and the expected results were obtained. The 48.5-kb fragment was amplified by PCR, and the same sequence was used for editing. In the first place, it is easy to choose the right one. Moreover, the conditions have been optimized, and the successful introduction of lambda DNA into the selection process has been demonstrated. Finally, we can confirm that there is no such thing as a complete list. In addition, the introduction of DNA synthesis and maintenance of DNA synthesis and maintenance of DNA synthesis enzyme DNMT5 is in progress. This is the first time that we have been able to improve the efficiency of the system.