膜タンパク質結晶化の支援法の開発-ABCタンパク質を中心に

(1)ペルオキシソームのABCトランスポーターALDPとPMP70のATP結合ドメインとマルトース結合タンパク質MBPとの融合タンパク質の結晶化を行うため、ALDPとPMP70とMBPとの融合タンパク質を大腸菌にて発現させて精製し動的光散乱を用いて結晶化に対する適性を判別した。しかし、残念ながらいずれも結晶化には適さない会合体であることが判明した。そこで、大腸菌以外の発現系を用いる系の検討を始めた。(2)ラットのMDRとSUR1を昆虫細胞SF-9を用いて発現させるシステムを構築した。その結果、ウエスタンブロットで発現を確認することができた。そこで、界面活性剤の適性を調べるとともに、小スケールでの精製を試みた。(3)糖鎖構造の詳細が解明されているリンゴ銀葉病菌由来ポリガラクチュロナーゼを用いて糖鎖の構造が結晶化に及ぼす影響の把握を試みた。その結果、糖鎖構造の存在は問題とならないが、構造の多様性がある場合には結晶化の障害となることが実験的に確認できた。すなわち、糖鎖構造に多様性がある場合は、動的光散乱による分子サイズの分布が多分散の様相を示し、結晶化を行っても結晶が得られないことがわかった。一方、結晶化できた、修飾糖鎖構造が単純な酵素は、X線結晶構造解析を行うことにおり、その三次元構造を明らかにすることができた。この結晶は、SPring-8のシンクロトロン放射光X線を用いた場合0.96Åを越える分解能を有しており、ARP/wARPプログラムを用いることにより、自動的に分子モデルを構築することができた。

(1)ペルオキシソームのABCトランスポーターALDPとPMP70のATP結合ドメインとマルトース結合タンパク質MBPとの融合タンパク質の結晶化を行うため、ALDPとPMP70とMBPとの融合タンパク質を大腸菌にて発現させて精製し動的光散乱を用いて結晶化に対する適性を判別した。しかし、残念ながらいずれも結晶化には適さない会合体であることが判明した。そこで、大腸菌以外の発現系を用いる系の検討を始めた。(2)ラットのMDRとSUR1を昆虫細胞SF-9を用いて発現させるシステムを構築した。その結果、ウエスタンブロットで発現を確認することができた。そこで、界面活性剤の適性を調べるとともに、小スケールでの精製を試みた。(3)糖鎖構造の詳細が解明されているリンゴ銀葉病菌由来ポリガラクチュロナーゼを用いて糖鎖の構造が結晶化に及ぼす影響の把握を試みた。その結果、糖鎖構造の存在は問題とならないが、構造の多様性がある場合には結晶化の障害となることが実験的に確認できた。すなわち、糖鎖構造に多様性がある場合は、動的光散乱による分子サイズの分布が多分散の様相を示し、結晶化を行っても結晶が得られないことがわかった。一方、結晶化できた、修飾糖鎖構造が単純な酵素は、X線結晶構造解析を行うことにおり、その三次元構造を明らかにすることができた。この結晶は、SPring-8のシンクロトロン放射光X線を用いた場合0.96Åを越える分解能を有しており、ARP/wARPプログラムを用いることにより、自動的に分子モデルを構築することができた。