糖鎖が構造形成におよぼす要因の解析と膜タンパク質結晶化への応用

影响糖链结构形成的因素分析及其在膜蛋白结晶中的应用

• 批准号: 13033044
• 负责人: 加藤 博章
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Kyoto University (2002)The Institute of Physical and Chemical Research (2001)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13033044/
• 关键词: 糖鎖修飾; 膜タンパク質; 結晶化; 昆虫細胞; 遺伝子発現; 多剤耐性; 抗癌剤; X線結晶解析

1.修飾糖鎖の解析について4ヶ所糖鎖の修飾を受けるリンゴ銀葉病菌由来エンドポリガラクツロナーゼのうち、2ヶ所(Ash92,Asn161)が修飾されているIaとその脱糖鎖型deIaについて超高分解能精密結晶構造解析を行った。また、オリゴガラクツロン酸との複合体を結晶化させることに成功し、サブサイト構造について明らかにすることができた。ついで、分解能を向上させることにより、水素の構造についても明らかにすることに成功した。さらに、中性子線解析によって、水素構造の確認を行うため、中性子線解析に必要となる巨大結晶(数ミリ立方メートル大)の作成を試みた。2.ABCトランスポーターについてガンの多剤耐性の原因となるMDR1と糖尿病薬スルホニルウレア剤のレセプターであるSUR1について、ヒトおよびマウス由来の遺伝子を用いてバキュロウイルスをベクターにした昆虫培養細胞(Sf-9)による発現系を構築し、得られた発現系を用いて活性型のタンパク質を大量生産(3リットルの液体培養)できる培養条件を確立した。また、細胞からミクロソーム画分を調製する方法を改良することにより収量を改良することができた。さらに、結晶化を補助するため、モノクロナール抗体から調製したFabフラグメントとの複合体を調製することを試みた。その結果、特定の界面活性剤を用いたときだけ複合体ができていることが判明した。

1. The modified sugar lock の parsing に つ い て sugar lock の modified by 4 ヶ を by け る リ ン ゴ silver leaf bacteria origin エ ン ド ポ リ ガ ラ ク ツ ロ ナ ー ゼ の う ち, 2 (Ash92 Asn161) by ヶ が modified さ れ て い る Ia と そ の off sugar type lock deIa に つ い て ultra-high precision crystal structure decomposition can parse を line っ た. ま た, オ リ ゴ ガ ラ ク ツ ロ ン acid と の complex を crystallization さ せ る こ と に successful し, サ ブ サ イ ト tectonic に つ い て Ming ら か に す る こ と が で き た. つ い で upward, can decompose を さ せ る こ と に よ り, water element の tectonic に つ い て も Ming ら か に す る こ と に successful し た. さ ら に, temper line in the analytic に よ っ て line, water element structure の confirm を う た め, temper line in the analytic に necessary と な る huge crystal (number ミ リ cubic メ ー ト ル) の made を try み た. 2. ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー に つ い て ガ ン の why so many tonic patience の と な る MDR1 と diabetes 薬 ス ル ホ ニ ル ウ レ ア tonic の レ セ プ タ ー で あ る SUR1 に つ い て, ヒ ト お よ び マ ウ ス origin の posthumous son 伝 を with い て バ キ ュ ロ ウ イ ル ス を ベ ク タ ー に し た insect culture cell (Sf - 9) に よ る 発 now を structure Build し, ら れ た 発 practice while department を い て activity type の タ ン パ ク qualitative を mass production (3 リ ッ ト ル の liquid culture) で き る culture conditions を establish し た. ま た, cell か ら ミ ク ロ ソ ー ム draw points を modulation す る method modified す を る こ と に よ り 収 quantity modified す を る こ と が で き た. さ ら に, crystallization を subsidies す る た め, モ ノ ク ロ ナ ー ル antibody か ら modulation し た Fab フ ラ グ メ ン ト と の complex modulation す を る こ と を try み た. そ の results, specific の interface active tonic を い た と き だ け complex が で き て い る こ と が.at し た.

项目成果

Tetsuya Shimizu: "Active-Site Architecture of Endopolygalacturonase I from the Pathogenic Fungus, Stereum purpureum, Revealed by Crystal Structures in Native and Ligan-Bound Forms at Atomic Resolution"Biochemistry. 41. 6651-6659 (2002)

Tetsuya Shimizu：“通过原子分辨率下的天然和配体结合形式的晶体结构揭示了致病性真菌 Stereum purpureum 的内多聚半乳糖醛酸酶 I 的活性位点结构”生物化学。

Tetsuya Shimizu: "Active-Site Architecture of Endopolygalacturonase I from the Pathogenic Fungus, Stereum purpureum, Revealed by Crystal Structures in Native and Ligan-Bound Forms at Atomic Resolution"Biochemistry. (In press). (2002)

Tetsuya Shimizu：“通过原子分辨率下的天然和配体结合形式的晶体结构揭示了致病性真菌 Stereum purpureum 的内多聚半乳糖醛酸酶 I 的活性位点结构”生物化学。

Emiko Yamauchi: "Crystal structure of MARCKS calmodulin-binding domain peptide complexed with Ca2+ Calmodulin"Nature. Struct. Biol.. 10. 226-231 (2003)

Emiko Yamauchi：“与 Ca2 钙调蛋白复合的 MARCKS 钙调蛋白结合域肽的晶体结构”自然。

Tetsuya Shimizu: "Crystallization and preliminary X-ray study of endopolygalacturonase from the pathogenic fungus Stereum purpureum"Acta Crystallographica Section D. 57. 1171-1173 (2001)

Tetsuya Shimizu：“来自病原真菌 Stereum purpureum 的内聚半乳糖醛酸酶的结晶和初步 X 射线研究”Acta Crystallographa 第 D. 57. 1171-1173 (2001)