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X線結晶解析とタンパク質工学的方法によるアスパラギン合成酵素の活性中心の決定

利用 X 射线晶体学和蛋白质工程方法测定天冬酰胺合酶的活性中心

基本信息

批准号：
08660108
负责人：
加藤博章
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、分子進化的な考察を基に、X線結晶解析と部位特異的アミノ酸置換を併用してアスパラギン合成酵素の活性中心残基を決定することにある。アスパラギン合成酵素とアスパラギン酸tRNA合成酵素について、X線結晶構造に基づくアミノ酸配列の比較から、アスパラギン合成酵素の活性中心残基であると考えられる4つの残基、Arg100、Gln116、Ser251、そしてArg299を取り上げ、部位特異的変異を行い、反応速度論的な性質を調べて変異導入の効果を評価した。その結果、R100KのK_m値は野性型と同程度の値を示したが、K_0は1/270に減少した。Q116Aでは基質ATPに対するK_m値は野生型と大きな差は見られなかったが基質L-Aspに対するK_m値は20倍に増大し、k0に関しては野生型の5倍に低下した。S251AのK_mは野性型とほぼ変わらなかったものの、k_0は1/200に減少した。また、R299QとR299Aはそれぞれk_0が1/800、1/600に減少したがK_m値は野生型と比べ著しい変化は見られなかった。以上の結果から、R100、S251、R299はいずれも基質の認識よりも酵素反応を加速させるために重要な残基であることが判明した。また、Q116Aの結果から、Q116とL-Aspのβ位のカルボキシル基の相互作用がL-Aspの認識に関与すると考えられた。従って、本酵素が、L-Aspのα位とβ位のカルボキシル基を区別するには、アスパラギン酸tRNA合成酵素で保存されていないQ116が重要な役割を持つと考えられた。

The purpose of this study was to investigate the molecular evolution of the base, X-ray crystallography analysis and site-specific aminic acid substitution and use of the active center residue of the synthetic enzyme to determine the active center residue.アスパラギン synthesis enzyme とアスパラギン acid tRNA synthesis enzyme について, X-ray crystal structure にbase Comparison of づくアミノacid coordination のから, アスパラギン synthesis enzyme active center residue であるとtest えられる4つのresidues, Arg100, Gln116, Ser251, そしてArg299をtakeり上げ, site-specific 変divergence を行い, and the なproperty of the reaction rate theory をadjusted べて変divergence introduction のeffect を価した.その results, R100K のK_m つは wild type とのつを show したが, K_0 は 1/270 にした. Q116A では matrix ATP に対するK_m値は wild type と大きなdifferent は见られなかったが matrix L-Aspに対するK_mつは20 times larger, k0に対してはwild type, 5 times lower. S251AのK_mはWild typeとほぼ変わらなかったものの、k_0は1/200にReduceした.また、R299QとR299Aはそれぞれk_0が1/800、1/600にReduceしたがK_m値はWild-typeと比べ恗い変化は见られなかった. The above results indicate that R100, S251, and R299 are the base of the base, and the enzyme reaction is accelerated and the important residues are clear.また, Q116A の result から, Q116 とL-Asp のβ-bit のカルボキシルbased のinteraction がL-Asp のcognition に关 and するとtest えられた.従って, this enzyme が, L-Asp α and β position のカルボキシルbased を difference するには, アスパラギン acid tRNA synthesis enzyme is important to preserve the enzyme Q116.

项目成果

期刊论文数量（2）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Toru Nakatsu: "Crystal Structure of Asparagine Synthetase from Escherichia coli B" Abstract for Congress of International Union of Crystallography. 17. C-114 (1996)

Toru Nakatsu：“来自大肠杆菌 B 的天冬酰胺合成酶的晶体结构”国际晶体学联盟大会摘要。

DOI：
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期刊：
影响因子：
0
作者：
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加藤博章: "いまタンパク質結晶学はどうなっている....第17回国際結晶学連合大会に出席して" 日本農芸化学会誌. 70. 1369-1371 (1996)

Hiroaki Kato：“蛋白质晶体学现在发生了什么......参加第 17 届国际晶体学联盟大会”日本农业化学学会杂志 70. 1369-1371 (1996)。

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发表时间：
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作者：
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加藤博章其他文献

Lafitidine-induced increase in intracellular Ca2+ concentrations in PC12 and endothelial cells.

拉菲替丁诱导 PC12 和内皮细胞细胞内 Ca2+ 浓度增加。

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
J.Pharmacol.Sci. 97
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作者：
Kashiwayama;Y.;Tsugumi Nakanishi;Takao Hibi;Hiroyuki Shibata;Tatsuya Uzumaki;Kentaro Ifuku;Toru Komatsu et al.;Mamoru Matsubara;Tasuku Ueno et al.;加藤博章;Yu Gabe et al.;Kazuki Kiyose et al.;Takuya Terai et al.;Takatoshi Yogo et al.;Mako Kamiya et al.;Kensuke Komatsu et al.;Eita Sasaki et al.;Yasuteru Urano et al.;Eri Kawabata et al.;Shigeki Hattori et al.;Tasuku Ueno et al.;Kenjiro Hanaoka et al.;Daisuke Nagata et al.;Suguru Kenmoku et al.;Yu Gabe et al.;Horie et al.;Kunieda et al.;Minowa et al.;Kunieda et al.
通讯作者：
Kunieda et al.

A General Synthesis of N-Reverse-Prenyl Indoles

N-反异戊二烯吲哚的一般合成

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发表时间：
2004
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作者：
Kashiwayama;Y.;Tsugumi Nakanishi;Takao Hibi;Hiroyuki Shibata;Tatsuya Uzumaki;Kentaro Ifuku;Toru Komatsu et al.;Mamoru Matsubara;Tasuku Ueno et al.;加藤博章;Yu Gabe et al.;Kazuki Kiyose et al.;Takuya Terai et al.;Takatoshi Yogo et al.;Mako Kamiya et al.;Kensuke Komatsu et al.;Eita Sasaki et al.;Yasuteru Urano et al.;Eri Kawabata et al.;Shigeki Hattori et al.;Tasuku Ueno et al.;Kenjiro Hanaoka et al.;Daisuke Nagata et al.;Suguru Kenmoku et al.;Yu Gabe et al.;Horie et al.;Kunieda et al.;Minowa et al.;Kunieda et al.;Minowa et al.;K.Yoshizawa;K.Yoshizawa;K.Yoshizawa;W.I.Li;Kubota et al.;T.Shioiri;F.Yokokawa
通讯作者：
F.Yokokawa