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X線結晶解析とタンパク質工学的方法によるアスパラギン合成酵素の活性中心の決定

利用 X 射线晶体学和蛋白质工程方法测定天冬酰胺合酶的活性中心

基本信息

批准号：
08660108
负责人：
加藤博章
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、分子進化的な考察を基に、X線結晶解析と部位特異的アミノ酸置換を併用してアスパラギン合成酵素の活性中心残基を決定することにある。アスパラギン合成酵素とアスパラギン酸tRNA合成酵素について、X線結晶構造に基づくアミノ酸配列の比較から、アスパラギン合成酵素の活性中心残基であると考えられる4つの残基、Arg100、Gln116、Ser251、そしてArg299を取り上げ、部位特異的変異を行い、反応速度論的な性質を調べて変異導入の効果を評価した。その結果、R100KのK_m値は野性型と同程度の値を示したが、K_0は1/270に減少した。Q116Aでは基質ATPに対するK_m値は野生型と大きな差は見られなかったが基質L-Aspに対するK_m値は20倍に増大し、k0に関しては野生型の5倍に低下した。S251AのK_mは野性型とほぼ変わらなかったものの、k_0は1/200に減少した。また、R299QとR299Aはそれぞれk_0が1/800、1/600に減少したがK_m値は野生型と比べ著しい変化は見られなかった。以上の結果から、R100、S251、R299はいずれも基質の認識よりも酵素反応を加速させるために重要な残基であることが判明した。また、Q116Aの結果から、Q116とL-Aspのβ位のカルボキシル基の相互作用がL-Aspの認識に関与すると考えられた。従って、本酵素が、L-Aspのα位とβ位のカルボキシル基を区別するには、アスパラギン酸tRNA合成酵素で保存されていないQ116が重要な役割を持つと考えられた。

The purpose of this study is to investigate the molecular evolution of the enzyme, X-ray crystallographic analysis, site-specific acid substitution, and determination of the active center residues of the enzyme. A comparative study of acid alignment in the X-ray crystallographic structure of the amino acid tRNA synthetase and its active center residues, Arg100, Gln116, Ser251, Arg299, site-specific variation, and the effect of rate-specific property modulation. As a result, the K_m value of R100K decreases by 1/270. The K_m value of Q11A for substrate ATP is 20 times higher than that of wild type, and the K_m value of Q11A for substrate L-Asp is 5 times lower than that of wild type. S251A K_m R299Q and R299A are reduced by 1/800 and 1/600 respectively. The above results show that R100, S251 and R299 are the most important residues in the enzyme reaction. The results of Q116A and Q116A show that the interaction between L-Asp and β-position is related to the understanding of L-Asp. Q116 is an important part of the enzyme's conservation process, and it is important to distinguish between the alpha and beta positions of L-Asp.

项目成果

期刊论文数量（2）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Toru Nakatsu: "Crystal Structure of Asparagine Synthetase from Escherichia coli B" Abstract for Congress of International Union of Crystallography. 17. C-114 (1996)

Toru Nakatsu：“来自大肠杆菌 B 的天冬酰胺合成酶的晶体结构”国际晶体学联盟大会摘要。

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

加藤博章: "いまタンパク質結晶学はどうなっている....第17回国際結晶学連合大会に出席して" 日本農芸化学会誌. 70. 1369-1371 (1996)

Hiroaki Kato：“蛋白质晶体学现在发生了什么......参加第 17 届国际晶体学联盟大会”日本农业化学学会杂志 70. 1369-1371 (1996)。

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作者：
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加藤博章其他文献

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作者：
Kashiwayama;Y.;Tsugumi Nakanishi;Takao Hibi;Hiroyuki Shibata;Tatsuya Uzumaki;Kentaro Ifuku;Toru Komatsu et al.;Mamoru Matsubara;Tasuku Ueno et al.;加藤博章;Yu Gabe et al.;Kazuki Kiyose et al.;Takuya Terai et al.;Takatoshi Yogo et al.;Mako Kamiya et al.;Kensuke Komatsu et al.;Eita Sasaki et al.;Yasuteru Urano et al.;Eri Kawabata et al.;Shigeki Hattori et al.;Tasuku Ueno et al.;Kenjiro Hanaoka et al.;Daisuke Nagata et al.;Suguru Kenmoku et al.;Yu Gabe et al.;Horie et al.;Kunieda et al.;Minowa et al.;Kunieda et al.
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Kashiwayama;Y.;Tsugumi Nakanishi;Takao Hibi;Hiroyuki Shibata;Tatsuya Uzumaki;Kentaro Ifuku;Toru Komatsu et al.;Mamoru Matsubara;Tasuku Ueno et al.;加藤博章;Yu Gabe et al.;Kazuki Kiyose et al.;Takuya Terai et al.;Takatoshi Yogo et al.;Mako Kamiya et al.;Kensuke Komatsu et al.;Eita Sasaki et al.;Yasuteru Urano et al.;Eri Kawabata et al.;Shigeki Hattori et al.;Tasuku Ueno et al.;Kenjiro Hanaoka et al.;Daisuke Nagata et al.;Suguru Kenmoku et al.;Yu Gabe et al.;Horie et al.;Kunieda et al.;Minowa et al.;Kunieda et al.;Minowa et al.;K.Yoshizawa;K.Yoshizawa;K.Yoshizawa;W.I.Li;Kubota et al.;T.Shioiri;F.Yokokawa
通讯作者：
F.Yokokawa