DNAアレイを用いた造血細胞分化におけるメチル化プロファイルの網羅的経時的検討

DNAのメチル化のON/OFFは遺伝子の発現制御の重要なメカニズムであるが、ゲノムのメチル化は個体の発生を通じて劇的な変化を受ける。本研究では、CGHアレイの技術を応用することにより造血幹細胞の発生・分化の過程でゲノムに生ずるメチル化の状態を網羅的に解析し、ゲノムのメチル化による造血発生の制御を明らかにすることを試みた。(1)CGHアレイを用いたゲノムのメチル化の網羅的解析ゲノムのBACクローンはRPCIより購入した。約3000クローンからなるBAC DNAをsmall scaleで調整し、DOP PCR法を用いてDNA増幅を行ったのち、GMS428アレイヤーを用いてガラススライド上にスポットすることによりゲノムアレイを作成した。CGH法によりメチル化解析法の基礎的検討を行う目的で、全骨髄細胞からゲノムDNAを調整し、メチル化特異的PCR法によりメチル化領域を含むゲノム断片をPCR増幅し、メチル化非特異的なPCRにより増幅したゲノムとともに、上記で作成したアレイ上でCGHを行った。上記の方法により、複数の領域について、メチル化特異的プローブによりシグナルの増強が確認された。(2)マウス造血幹細胞の分画とDNA調整マウスより骨髄単核球細胞を採取し、FACS Vantageによりc-Kit+Scal+Linage-の分画のソーティングを行い、得られた1x10^5個の細胞からゲノムDNAの抽出を行い、約2ugのDNAを回収した。今後得られた造血幹細胞分画のゲノムとlinage-細胞のゲノムの比較を行うことにより、造血幹細胞の分化に伴って特異的にメチル化を受けるゲノム領域の同定を試みる予定である。

DNAのメチル化のON/OFFは遺伝子の発現制御の重要なメカニズムであるが、ゲノムのメチル化は個体の発生を通じて劇的な変化を受ける。本研究では、CGHアレイの技術を応用することにより造血幹細胞の発生・分化の過程でゲノムに生ずるメチル化の状態を網羅的に解析し、ゲノムのメチル化による造血発生の制御を明らかにすることを試みた。(1)CGHアレイを用いたゲノムのメチル化の網羅的解析ゲノムのBACクローンはRPCIより購入した。約3000クローンからなるBAC DNAをsmall scaleで調整し、DOP PCR法を用いてDNA増幅を行ったのち、GMS428アレイヤーを用いてガラススライド上にスポットすることによりゲノムアレイを作成した。CGH法によりメチル化解析法の基礎的検討を行う目的で、全骨髄細胞からゲノムDNAを調整し、メチル化特異的PCR法によりメチル化領域を含むゲノム断片をPCR増幅し、メチル化非特異的なPCRにより増幅したゲノムとともに、上記で作成したアレイ上でCGHを行った。上記の方法により、複数の領域について、メチル化特異的プローブによりシグナルの増強が確認された。(2)マウス造血幹細胞の分画とDNA調整マウスより骨髄単核球細胞を採取し、FACS Vantageによりc-Kit+Scal+Linage-の分画のソーティングを行い、得られた1x10^5個の細胞からゲノムDNAの抽出を行い、約2ugのDNAを回収した。今後得られた造血幹細胞分画のゲノムとlinage-細胞のゲノムの比較を行うことにより、造血幹細胞の分化に伴って特異的にメチル化を受けるゲノム領域の同定を試みる予定である。