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膜透過化細胞を用いたセントロメアクロマチン集合機構の解析

使用膜透化细胞分析着丝粒染色质组装机制

基本信息

批准号：
17657004
负责人：
深川竜郎
金额：
$ 2.18万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

染色体分配に必須の働きを担うセントロメア領域がいかにして決定されるのかについて未知な点が数多くある。最近では、セントロメア形成には、必ずしもDNA一次配列情報が必要でなく、セントロメア特異的なヒストンであるCENP-Aがセントロメア特異的なクロマチン構造を形成して、それを複数のタンパク質が認識してセントロメアとして機能すると予想されている。本研究では、CENP-Aのセントロメアクロマチンへの取込み活性の同定とその反応を司る分子実体の解明をめざした。昨年度は、CENP-Aのセントロメアクロマチンへの取込み活性の同定とその反応を司る分子実体の解明を、膜透過化細胞を用いて行った。これまでの研究では、CENP-A-GFPがセントロメアへ取り込まれるかを解析した。その結果、CENP-Aは、ヒストン分子として核内クロマチンに取り込まれることは、確認できたが、セントロメア特異的に取り込まれる条件は得られなかった。本年度は、CENP-Aと直接的に結合するタンパク質の同定を平行して行い、セントロメア領域を決定する重要因子の同定を目指した。その結果、我々独自の精製法を確立することができ、複数のCENP-A相互作用因子を見いだした。また、昨年度までの研究の過程で、浮遊系のリンパ細胞おいて、Amaxa社のエレクトロポーレーション装置を用いることで、高効率で遺伝子を細胞へ導入できる条件を見いだした。そこで、ニワトリDT40細胞へCENP-GFP遺伝子を発現させた結果、約80%の細胞で、CENP-A-GFPがセントロメアへ局在化することを確認できた。そこで、CENP-Aの取り込みに関わると予想されるタンパク質に関して、DT40細胞で条件的ノックアウト細胞を作成して、対象遺伝子の非存在下でCENP-A-GFPの取り込みアッセイを行い、実際にその因子がCENP-Aの取り込みに関わっているかどうかを検証した。この方法でCENP-H/Iふぐ抗体タンパク質がCENP-Aの取り込みに関わっていることを示せた。

The distribution of chromosomes must be determined by the number of unknown points in the field. Recently, you have to use the DNA to make sure that you need to make sure that you need to use the necessary information, and that you need to use the special information on the CENP-A. You need to make a copy of the information that you want to make. In this study, CENP-A was used to determine the activity of the molecule. Last year, CENP-A was used to determine the activity of the molecular system, and the membrane permeation assay was used. Please do the research, CENP-A-GFP the research and the analysis. The results, CENP-A, and other components in the core are required to obtain the correct information, confirm that the information is correct, and that the special conditions are correct. In the current year, the direct results of the CENP-A system are the same as those of the parallel operation line and the target index of the important factors. According to the results of the experiment, we used our own method to make sure that the CENP-An interaction factors were isolated, and the complex data were analyzed. The whole process of last year's study, the system of floatation, the use of equipment in the Amaxa community, the use of equipment, and the availability of high-rate equipment in recent years. The results show that the results are about 80% of the total number of DT40 cells, and that CENP-A-GFP cells are in the process of making sure that the results are not correct. Do you want to know if you want to use the CENP-A-GFP, CENP-A, CENP-A, and so on, if you want to do so, you may want to use the data from the cell, the cell. Methods: CENP-H/I antibodies, antibodies, CENP-A, samples, etc.