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膜透過化細胞を用いたセントロメアクロマチン集合機構の解析

使用膜透化细胞分析着丝粒染色质组装机制

基本信息

批准号：
17657004
负责人：
深川竜郎
金额：
$ 2.18万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

染色体分配に必須の働きを担うセントロメア領域がいかにして決定されるのかについて未知な点が数多くある。最近では、セントロメア形成には、必ずしもDNA一次配列情報が必要でなく、セントロメア特異的なヒストンであるCENP-Aがセントロメア特異的なクロマチン構造を形成して、それを複数のタンパク質が認識してセントロメアとして機能すると予想されている。本研究では、CENP-Aのセントロメアクロマチンへの取込み活性の同定とその反応を司る分子実体の解明をめざした。昨年度は、CENP-Aのセントロメアクロマチンへの取込み活性の同定とその反応を司る分子実体の解明を、膜透過化細胞を用いて行った。これまでの研究では、CENP-A-GFPがセントロメアへ取り込まれるかを解析した。その結果、CENP-Aは、ヒストン分子として核内クロマチンに取り込まれることは、確認できたが、セントロメア特異的に取り込まれる条件は得られなかった。本年度は、CENP-Aと直接的に結合するタンパク質の同定を平行して行い、セントロメア領域を決定する重要因子の同定を目指した。その結果、我々独自の精製法を確立することができ、複数のCENP-A相互作用因子を見いだした。また、昨年度までの研究の過程で、浮遊系のリンパ細胞おいて、Amaxa社のエレクトロポーレーション装置を用いることで、高効率で遺伝子を細胞へ導入できる条件を見いだした。そこで、ニワトリDT40細胞へCENP-GFP遺伝子を発現させた結果、約80%の細胞で、CENP-A-GFPがセントロメアへ局在化することを確認できた。そこで、CENP-Aの取り込みに関わると予想されるタンパク質に関して、DT40細胞で条件的ノックアウト細胞を作成して、対象遺伝子の非存在下でCENP-A-GFPの取り込みアッセイを行い、実際にその因子がCENP-Aの取り込みに関わっているかどうかを検証した。この方法でCENP-H/Iふぐ抗体タンパク質がCENP-Aの取り込みに関わっていることを示せた。

Chromosome allocation must be determined by the determination of the area and the unknown number of points. Recently, it has formed a には, a セントロメアには, a necessary DNA primary alignment information, a でなく, a セントロメアspecific なヒストンであるCENP-AがセントロメアSpecial なクロマチン structure を formation して, それを plural のタンパク性が知してセントロメアとしてFUNCTION すると于思されている. In this study, we found that CENP-A's active molecular structure was the same as that of CENP-A's active molecular structure. Yesterday's year, CENP-Aのセントロメアクロマチンへのtake込みactiveの Same Determine the molecular structure of the reaction system and the membrane permeability of the cell. Research and analysis of CENP-A-GFP.そのRESULTS, CENP-Aは, ヒストンmolecule として内クロマチンにGET り込まれることは、Confirmationできたが、セントロメアSpecial にGETり込まれるconditionsはgetられなかった. This year, CENP-A is a direct combination of quality and parallelism, and the determination of important factors in the field of design and design. As a result, we established our original purification method and established the complex CENP-A interaction factor.また, last year's までの research process で, planktonic system のリンパcell おいて, Amaxa company のエレクトロThe ポーレーション device is used and the conditions for high-efficiency and high-efficiency でで缝子をtransfer cells are introduced できる见いだした. The results of そこで, ニワトリDT40 cells and CENP-GFP legacy, about 80 % of cells, CENP-A-GFP sterilization is confirmed.そこで、CENP-AのGET り込みに关わると yu want to されるタンパク性に关して, DT40 cells are made of ノックアウトcells with the same conditions CENP-A-GFP in the non-presence of CENP-A-GFPそのfactorがCENP-AのGETり込みに关わっているかどうかを検证した.このmethodでCENP-H/Iふぐantibody タンパク性がCENP-Aの取り込みに关わっていることをshowせた.