膜透過化細胞を用いたセントロメアクロマチン集合機構の解析

染色体分配に必須の働きを担うセントロメア領域がいかにして決定されるのかについて未知な点が数多くある。最近では、セントロメア形成には、必ずしもDNA一次配列情報が必要でなく、セントロメア特異的なヒストンであるCENP-Aがセントロメア特異的なクロマチン構造を形成して、それを複数のタンパク質が認識してセントロメアとして機能すると予想されている。本研究では、CENP-Aのセントロメアクロマチンへの取込み活性の同定とその反応を司る分子実体の解明をめざした。昨年度は、CENP-Aのセントロメアクロマチンへの取込み活性の同定とその反応を司る分子実体の解明を、膜透過化細胞を用いて行った。これまでの研究では、CENP-A-GFPがセントロメアへ取り込まれるかを解析した。その結果、CENP-Aは、ヒストン分子として核内クロマチンに取り込まれることは、確認できたが、セントロメア特異的に取り込まれる条件は得られなかった。本年度は、CENP-Aと直接的に結合するタンパク質の同定を平行して行い、セントロメア領域を決定する重要因子の同定を目指した。その結果、我々独自の精製法を確立することができ、複数のCENP-A相互作用因子を見いだした。また、昨年度までの研究の過程で、浮遊系のリンパ細胞おいて、Amaxa社のエレクトロポーレーション装置を用いることで、高効率で遺伝子を細胞へ導入できる条件を見いだした。そこで、ニワトリDT40細胞へCENP-GFP遺伝子を発現させた結果、約80%の細胞で、CENP-A-GFPがセントロメアへ局在化することを確認できた。そこで、CENP-Aの取り込みに関わると予想されるタンパク質に関して、DT40細胞で条件的ノックアウト細胞を作成して、対象遺伝子の非存在下でCENP-A-GFPの取り込みアッセイを行い、実際にその因子がCENP-Aの取り込みに関わっているかどうかを検証した。この方法でCENP-H/Iふぐ抗体タンパク質がCENP-Aの取り込みに関わっていることを示せた。

染色体分配に必須の働きを担うセントロメア領域がいかにして決定されるのかについて未知な点が数多くある。最近では、セントロメア形成には、必ずしもDNA一次配列情報が必要でなく、セントロメア特異的なヒストンであるCENP-Aがセントロメア特異的なクロマチン構造を形成して、それを複数のタンパク質が認識してセントロメアとして機能すると予想されている。本研究では、CENP-Aのセントロメアクロマチンへの取込み活性の同定とその反応を司る分子実体の解明をめざした。昨年度は、CENP-Aのセントロメアクロマチンへの取込み活性の同定とその反応を司る分子実体の解明を、膜透過化細胞を用いて行った。これまでの研究では、CENP-A-GFPがセントロメアへ取り込まれるかを解析した。その結果、CENP-Aは、ヒストン分子として核内クロマチンに取り込まれることは、確認できたが、セントロメア特異的に取り込まれる条件は得られなかった。本年度は、CENP-Aと直接的に結合するタンパク質の同定を平行して行い、セントロメア領域を決定する重要因子の同定を目指した。その結果、我々独自の精製法を確立することができ、複数のCENP-A相互作用因子を見いだした。また、昨年度までの研究の過程で、浮遊系のリンパ細胞おいて、Amaxa社のエレクトロポーレーション装置を用いることで、高効率で遺伝子を細胞へ導入できる条件を見いだした。そこで、ニワトリDT40細胞へCENP-GFP遺伝子を発現させた結果、約80%の細胞で、CENP-A-GFPがセントロメアへ局在化することを確認できた。そこで、CENP-Aの取り込みに関わると予想されるタンパク質に関して、DT40細胞で条件的ノックアウト細胞を作成して、対象遺伝子の非存在下でCENP-A-GFPの取り込みアッセイを行い、実際にその因子がCENP-Aの取り込みに関わっているかどうかを検証した。この方法でCENP-H/Iふぐ抗体タンパク質がCENP-Aの取り込みに関わっていることを示せた。