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染色体工学を用いたセントロメアを中心とするゲノム構築原理の解明

利用染色体工程阐明以着丝粒为中心的基因组构建原理

基本信息

批准号：
16011260
负责人：
深川竜郎
金额：
$ 4.8万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16011260/
关键词：
セントロメア DT40 CENP-H CENP-I Nuf2 Hec1 RNAiマシーナリー Dicer

项目摘要

ゲノム配列が解読された後は、ゲノムそのものが構築される原理を解明することが重要である。本研究では複雑なゲノム構築原理の内、ゲノム分配機構に焦点を当て染色体工学的な手法を用いて、高等動物セントロメアの形成機構の解明を目指す。本年度は、これまでの研究の継続性を重視してニワトリB細胞由来のDT40細胞を用いて新規セントロメアタンパク質の同定と機能解析を行った。また、セントロメア構築とRNAiマシーナリーとの関連の解明を目指した。以下に結果を述べる。1)昨年度までの研究で同定したKm23aおよびKm23bのコンディショナルノックアウト細胞を樹立してその表現型を解析した。その結果、Km23aおよびKm23bのノックアウト細胞では、異常スピンドルとチェックポイント制御の異常が観察された。ダイニンと結合することから、Km23aおよびbはモータータンパク質に関連したスピンドルチェックポイントタンパク質である可能性が示唆された。2)セントロメア構成タンパク質であるCENP-HおよびCENP-Iの発現をタグ付き融合タンパク質の発現に置換した細胞株を樹立して抗タグ抗体を用いた免疫沈降実験を行った。その結果、CENP-HとCENP-Iを含む巨大複合体を精製できた。質量分析によるアミノ酸配列の決定に引き続きcDNAクローニングを行い、複合体に含まれる5種類のタンパク質を同定した。いずれも、細胞周期を通じてセントロメアへ局在していた。3)ヒト染色体由来の人工染色体を保持するDT40細胞を対象にして、RNAiマシーナリーに関与するDicer遺伝子の条件的ノックアウト細胞を樹立した。Dicerの発現が失われた細胞で、ヒト人工染色体のセントロメア領域からのRNA転写が確認できた。RNaseプロテクションアッセイの結果、2本鎖RNAを形成することが示唆された。また、Dicerノックアウト細胞で、ヘテロクロマチンの形成異常が確認できた。

The ゲノムmatching arrangement が解読された后は, the ゲノムそのものが construction される principle を Explain the clarification することがimportant である. This study focuses on the principles of construction of new structures, the focus of distribution mechanisms, and the use of chromosome engineering techniques, and the explanation of the formation mechanisms of higher animals. This year's research focuses on the origin of B cells. 40 cells are used for new rules and functions.また, セントロメアconstructs とRNAiマシーナリーとのrelated の解明を Eyes refers to した. The results are described below. 1) Yesterday’s research on the same results as Km23a Km23b Km23bンディショナルノックアウト Cell をEstablishment してそのphenotypeをAnalysisした.そのRESULTS、Km23aおよびKm23bのノックアウトcell では, abnormal スピンドルとチェックポイントcontrolled abnormal が観看された.ダイニンと合することから、Km23aおよびbはモータータンパク性にRelated したスピンドルチェックポイントタンパクquality であるpossibilityがshows instigationされた. 2) セントロメア constitutes タンパクquality であるCENP-H およびCENP-Iの発成をタグpayき melt In order to establish the anti-Immune antibody in the replacement cell line and use it to immunoprecipitate the antibody, it is now available in the laboratory. As a result, CENP-H and CENP-I contain a huge complex and are refined. Quality analysis of the acid sequence of the acid sequence, the cDNA sequence, and the complex sequence of the 5 kinds of compounds.いずれも、Cell cycle を通じてセントロメアへbureau in していた. 3) Artificial chromosomes derived from ヒトchromosomes, artificial chromosomes, DT40 cells, RNAiマシーナリーに关 and するDicer 伝子のconditions of the ノックアウトcell をestablishmentした. Dicer's の発appears and loses its cells, and ヒトartificial chromosome's field and RNA 転writes its confirmation. RNase プロテクションアッセイの results, 2-lock RNA を formation することが时憆された.また、Dicerノックアウトcellで、ヘテロクロマチンの abnormality confirmationできた.