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遺伝学・染色体工学的手法を用いた高等脊椎動物のセントロメア形成機構の解明

利用遗传学和染色体工程方法阐明高等脊椎动物着丝粒形成机制

基本信息

批准号：
14704002
负责人：
深川竜郎
金额：
$ 18.89万
依托单位：
National Institute of Genetics (2003-2004)The Graduate University for Advanced Studies (2002)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14704002/
关键词：
セントロメア DT40細胞 CENP-A CENP-H CENP-I 染色体分配キネトコア RNAiマシーナリー Nuf2 Dicer ZW10 チェックポイント

项目摘要

生物が生命を維持するためには、ゲノム情報を包括する構造体である染色体が安定に保持・増殖されなければならない。正常な細胞では、ほぼ決まった時間周期でゲノムの複製と分配が正確に行われる。染色体複製・分配のような基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、がん化など細胞に対する悪影響が生じる。したがって、染色体複製や分配の正確な分子機構を解明することは、遺伝学における本質的な課題の一つである。我々は、染色体分配に重要な働きを担うセントロメアの機能解析を行っている。本研究では、哺乳類細胞の数十から数百倍の頻度で相同組換えが起こるニワトリDT40細胞を用いた各種セントロメアタンパク質のノックアウト解析法を通じて、高等脊椎動物のセントロメアの形成に関する分子機構の理解を目指している。本年度は、CENP-Aノックアウト株の詳細な表現型解析と、新規セントロメアタンパク質の同定および機能解析を中心に研究を進めた。さらに、RNAiマシーナリーとセントロメア構築との関連解明に向けた研究も行った。1)CENP-Aのノックアウト細胞の解析の結果、Mad2およびBubR1というチェックポイントタンパク質の局在異常が観察できた。CENP-Aのノックアウト株では、最初に紡錘体チェックポイント機構の活性化が起きて、細胞周期がM期で遅延した後、分裂後期に入って行くことから、CENP-Aはチェックポイントの「活性化」より「維持」に影響を与えると結論した。2)新規セントロメアタンパク質の同定を目指して、CENP-HとCENP-Iを含む巨大複合体を精製した。質量分析によるアミノ酸配列の決定に引き続きcDNAクローニングを行い、複合体に含まれる5種類のタンパク質を同定した。いずれも、細胞周期を通じてセントロメアへ局在していた。それらのノックアウト細胞の樹立に成功した。3)RNAiマシーナリーに関与するDicer遺伝子の条件的ノックアウト細胞を解析した結果、Dicerはヘテロクロマチン構築と姉妹染色分体の結合に重要な働きを担っていると結論した。

Life support, including chromosome stability and reproduction Normal cells are divided into two groups: one is the time period of reproduction, the other is the time period of reproduction. Chromosome duplication, distribution, and other basic biological factors affect the development of chromosome heterogenization and transformation. To understand the correct molecular mechanism for chromosome replication and distribution is a key issue in genetics. We are responsible for the functional analysis of chromosome distribution. This study aims to provide insights into molecular mechanisms involved in the formation of the same molecular structure in mammalian cells, using analytical methods for the identification of different molecular structures in DT40 cells. This year, CENP-A has made progress in the study of detailed phenotype analysis, new regulation, quality identification and function analysis of its strains. The research on the relationship between the two groups was carried out. 1)CENP-A analysis results of cells, Mad2 BubR1 CENP-A has the effect of activation and maintenance of the initial spindle structure, cell cycle delay in M phase and anaphase. 2)The new regulation refers to the identification of CENP-H and CENP-I, which contain large complexes. Quality analysis of the amino acid sequence determination of the cDNA sequence, the complex contains five species of DNA sequence determination In the middle of the cell cycle, the cell cycle changes. The cells were successfully established. 3) The analysis results of Dicer gene expression conditions, Dicer gene expression construction, and Dicer chromatid binding are important for RNAi analysis.