遺伝学・染色体工学的手法を用いた高等脊椎動物のセントロメア形成機構の解明

利用遗传学和染色体工程方法阐明高等脊椎动物着丝粒形成机制

基本信息

批准号：
14704002
负责人：
深川竜郎
金额：
$ 18.89万
依托单位：
National Institute of Genetics (2003-2004)The Graduate University for Advanced Studies (2002)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14704002/
关键词：
セントロメア DT40細胞 CENP-A CENP-H CENP-I 染色体分配キネトコア RNAiマシーナリー Nuf2 Dicer ZW10 チェックポイント

项目摘要

生物が生命を維持するためには、ゲノム情報を包括する構造体である染色体が安定に保持・増殖されなければならない。正常な細胞では、ほぼ決まった時間周期でゲノムの複製と分配が正確に行われる。染色体複製・分配のような基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、がん化など細胞に対する悪影響が生じる。したがって、染色体複製や分配の正確な分子機構を解明することは、遺伝学における本質的な課題の一つである。我々は、染色体分配に重要な働きを担うセントロメアの機能解析を行っている。本研究では、哺乳類細胞の数十から数百倍の頻度で相同組換えが起こるニワトリDT40細胞を用いた各種セントロメアタンパク質のノックアウト解析法を通じて、高等脊椎動物のセントロメアの形成に関する分子機構の理解を目指している。本年度は、CENP-Aノックアウト株の詳細な表現型解析と、新規セントロメアタンパク質の同定および機能解析を中心に研究を進めた。さらに、RNAiマシーナリーとセントロメア構築との関連解明に向けた研究も行った。1)CENP-Aのノックアウト細胞の解析の結果、Mad2およびBubR1というチェックポイントタンパク質の局在異常が観察できた。CENP-Aのノックアウト株では、最初に紡錘体チェックポイント機構の活性化が起きて、細胞周期がM期で遅延した後、分裂後期に入って行くことから、CENP-Aはチェックポイントの「活性化」より「維持」に影響を与えると結論した。2)新規セントロメアタンパク質の同定を目指して、CENP-HとCENP-Iを含む巨大複合体を精製した。質量分析によるアミノ酸配列の決定に引き続きcDNAクローニングを行い、複合体に含まれる5種類のタンパク質を同定した。いずれも、細胞周期を通じてセントロメアへ局在していた。それらのノックアウト細胞の樹立に成功した。3)RNAiマシーナリーに関与するDicer遺伝子の条件的ノックアウト細胞を解析した結果、Dicerはヘテロクロマチン構築と姉妹染色分体の結合に重要な働きを担っていると結論した。

为了使生物保持生命，必须稳定地维持和增殖的染色体，这些结构是涵盖基因组信息的结构。在正常细胞中，基因组复制和分布在大约固定时间段内准确地进行。如果诸如染色体复制和分布之类的基本生物学反应受到破坏，则对细胞（例如染色体非整倍化和癌症）的不利影响。因此，阐明染色体复制和分布的精确分子机制是遗传学中的基本挑战之一。我们正在对中心粒进行功能分析，这些功能在染色体分布中起着重要作用。这项研究旨在通过使用鸡DT40细胞对各种丝粒蛋白的敲除分析来理解较高脊椎动物中丝粒的分子机制，在这种分析中，同源重组比哺乳动物细胞更频繁地发生数十倍至数百倍。今年，我们专注于CENP-A敲除菌株的详细表型分析以及新型的丝粒蛋白的鉴定和功能分析。此外，我们还进行了研究，以阐明RNAi机械与Centromere Construction之间的关系。 1）CENP-A基因敲除细胞的分析显示了称为MAD2和BUBR1的检查点蛋白质的异常定位。在CENP-A的敲除应变中，首先激活主轴检查点机制，并且细胞周期在M期延迟，然后进入晚期有丝分裂阶段，我们得出的结论是，CENP-A对“维持”的作用而不是检查点的“激活”。 2）纯化含有CENP-H和CENPI的巨型复合物，目的是鉴定新型的丝粒蛋白。通过质谱测定氨基酸序列后，进行cDNA克隆以识别络合物中包含的五种蛋白质。在整个细胞周期中，两者都位于中心粒。他们能够建立这些敲除细胞。 3）在分析了参与RNAi机械的DICER基因的条件基因敲除细胞之后，我们得出的结论是，DICER在异染色质构建和姊妹染色质酸的结合中起重要作用。