染色体工学を用いたセントロメアを中心とするゲノム構築原理の解明

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ゲノム配列が解読された後は、ゲノムそのものが構築される原理を解明することが重要である。本研究では複雑なゲノム構築原理の内、ゲノム分配機構に焦点を当て染色体工学的な手法を用いて、高等動物セントロメアの形成機構の解明を目指す。本年度は、これまでの研究の継続性を重視してニワトリB細胞由来のDT40細胞を用いてCENP-A、Nuf2、Hec1を対象に条件的ノックアウト細胞の作成と表現型の解析を行った。以下に結果を述べる。1)Nuf2およびNuf2と相互作用するセントロメアタンパク質Hec1のノックアウト株を作成した。両ノックアウト細胞株の表現系解析から、いずれの株も約450分の細胞分裂遅延を起こした後死滅することが分かった。その際、CENP-A,-C,-Hなどのインナーセントロメアタンパク質の局在に変化は見られなかった。一方CENP-HやCENP-Iのノックアウト株においてNuf2やHec1の量が減少していた。また、Hec1は細胞周期チェックポイントタンパク質であるMad2と結合していることが分かった。さらにFRAP解析の結果、Nuf2複合体はセントロソームにおいてダイナミックな挙動をして、セントロメアでは、安定した構造をとることを明らかにした。2)CENP-Aのノックアウト細胞でBubR1というチェックポイントタンパク質の局在が失われた。CENP-Aのノックアウト株では、最初に紡錘体チェックポイント機構の活性化が起きて、細胞周期がM期で遅延した後、分裂後期に入って行くことから、CENP-Aはチェックポイントの「活性化」より「維持」に影響を与えると結論した。3)ヒト染色体由来の人工染色体を保持するDT40細胞を対象にして、RNAiマシーナリーに関与するDicer遺伝子の条件的ノックアウト細胞を樹立した。Dicerの発現が失われた細胞で、ヒト人工染色体のセントロメア領域からのRNA転写が確認できた。セントロメア形成に関わるDicerの影響を現在解析している。