染色体工学を用いたセントロメアを中心とするゲノム構築原理の解明

利用染色体工程阐明以着丝粒为中心的基因组构建原理

基本信息

批准号：
15011218
负责人：
深川竜郎
金额：
$ 3.52万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15011218/
关键词：
セントロメア DT40 CENP-A Nuf2 Hec1 RNAiマシーナリー Dicer ゲノム構築原理

项目摘要

ゲノム配列が解読された後は、ゲノムそのものが構築される原理を解明することが重要である。本研究では複雑なゲノム構築原理の内、ゲノム分配機構に焦点を当て染色体工学的な手法を用いて、高等動物セントロメアの形成機構の解明を目指す。本年度は、これまでの研究の継続性を重視してニワトリB細胞由来のDT40細胞を用いてCENP-A、Nuf2、Hec1を対象に条件的ノックアウト細胞の作成と表現型の解析を行った。以下に結果を述べる。1)Nuf2およびNuf2と相互作用するセントロメアタンパク質Hec1のノックアウト株を作成した。両ノックアウト細胞株の表現系解析から、いずれの株も約450分の細胞分裂遅延を起こした後死滅することが分かった。その際、CENP-A,-C,-Hなどのインナーセントロメアタンパク質の局在に変化は見られなかった。一方CENP-HやCENP-Iのノックアウト株においてNuf2やHec1の量が減少していた。また、Hec1は細胞周期チェックポイントタンパク質であるMad2と結合していることが分かった。さらにFRAP解析の結果、Nuf2複合体はセントロソームにおいてダイナミックな挙動をして、セントロメアでは、安定した構造をとることを明らかにした。2)CENP-Aのノックアウト細胞でBubR1というチェックポイントタンパク質の局在が失われた。CENP-Aのノックアウト株では、最初に紡錘体チェックポイント機構の活性化が起きて、細胞周期がM期で遅延した後、分裂後期に入って行くことから、CENP-Aはチェックポイントの「活性化」より「維持」に影響を与えると結論した。3)ヒト染色体由来の人工染色体を保持するDT40細胞を対象にして、RNAiマシーナリーに関与するDicer遺伝子の条件的ノックアウト細胞を樹立した。Dicerの発現が失われた細胞で、ヒト人工染色体のセントロメア領域からのRNA転写が確認できた。セントロメア形成に関わるDicerの影響を現在解析している。

一旦基因组序列被解码，重要的是要了解构建基因组本身的原理。这项研究的重点是复杂基因组构建原理的基因组分布机制，并旨在使用染色体工程技术阐明较高动物centromeres的机制。今年，我们使用源自鸡肉B细胞的DT40细胞使用源自鸡B细胞的DT40细胞来创建有条件的基因敲除细胞并分析CENP-A，NUF2和HEC1的表型。结果将在下面说明。 1）创建了与NUF2和NUF2相互作用的中心蛋白HEC1的基因敲除菌株。对两种基因敲除细胞系的表型分析都表明，两种菌株在细胞分裂延迟约450分钟后死亡。目前，在内侧丝粒蛋白（例如CENP -A，-C，-H）的定位中尚未观察到任何变化。另一方面，在CENP-H和CENP-I的基因敲除菌株中，NUF2和HEC1的量减少。还发现HEC1与细胞周期检查点蛋白MAD2结合。此外，FRAP分析表明，NUF2复合物在中心体中动态行为，在中心粒中具有稳定的结构。 2）在CENP-A的基因敲除细胞中丢失了检查点蛋白BUBR1的定位。在CENP-A的敲除应变中，首先激活主轴检查点机制，并且细胞周期在M期延迟，然后进入晚期有丝分裂阶段，我们得出的结论是，CENP-A对“维持”的作用而不是检查点的“激活”。 3）在携带源自人类染色体的人造染色体的DT40细胞中，建立了参与RNAi机械的迪切尔基因的条件基因敲除细胞。在丢失dicer表达的细胞中，从人造染色体的centromeric区域进行了RNA转录。我们目前正在分析迪切尔对丝粒形成的影响。