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オートファジーの定量的評価方法の開発

自噬定量评价方法的建立

基本信息

批准号：
17657069
负责人：
水島昇
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University (2006)Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research (2005)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本課題では哺乳類細胞を用いて、客観性のあるオートファジーの定量的評価方法を開発することを目的としている。昨年度から試みているpH感受性色素(CypHer5)で細胞質からリソソームへの移動を追跡する方法を今年度さらに検討を重ねた。CypHer5をBSAやIgGなどのタンパク質に共有結合させ、これを細胞質にマイクロインジェクションした。その結果、リソソームへの移動がかなり抑制されたが依然としてマクロオートファジー非依存的にリソソームへ到達してしまうことが結論された。現在ワルトマニンなどのPI3K阻害剤などを用いて、ミクロオートファジーの関与などをさらに追求している。現在のオートファジーの定量的解析の問題点のひとつとして、オートファジーの理想的な阻害方法がないことがあげられる。そこで、私たちはAtg5ノックアウトマウスに由来する線維芽細胞を利用して、テトラサイクリンによる遺伝子誘導系を利用して、「突然」オートファジー能を欠損あるいは回復できる細胞株を作製した。例えばこれを用いることによってオートファジーは通常の培地で培養している限り細胞の大きさにはほとんど影響しないが、栄養飢餓による細胞萎縮には正の関与をしていることなどを明らかとした。また現在多くの研究においてLC3というオートファゴソーム膜タンパク質の挙動でオートファジーの活性が評価されているが、LC3の標識が真のオートファゴソームを示すだけではなく、単なるタンパク質凝集に非特異的に含まれてしまう場合があることに気がついた。そこでこの方法の問題点と対応策についても論文発表を行った。

The purpose of this project is to develop a quantitative evaluation method for mammalian cells. This year's study focuses on the following methods for tracing the movement of pH-sensitive pigments (Cyp Her 5) in cytoplasm Cypher5 is a protein that binds to the cytoplasm of BSA and has a strong affinity with the cytoplasm. The result is that the software is still in the process of being released, and the software is not dependent on the software. Now, the PI 3K inhibitor is used in the process, and the PI 3K inhibitor is used in the process. Now the quantitative analysis of the problem point of the problem, the ideal of the problem prevention method The cell line was developed by using a "sudden" induction system for the induction of embryos in line with the "sudden" induction system. For example, if you are hungry, you will not be able to grow. In the present study, LC3 and LC3 were studied in detail. The activity of LC3 and LC3 was evaluated. The identification of LC3 and LC3 was evaluated in detail. The results showed that LC3 and LC3 were not specific. The problem of this method is that it is difficult to solve the problem.