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細胞を用いる糖鎖生産とEGFRリン酸化阻害剤の開発

使用细胞生产聚糖并开发 EGFR 磷酸化抑制剂

基本信息

批准号：
19655060
负责人：
畑中研一
金额：
$ 2.05万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

動物細胞を糖鎖生産工場と見立てて糖脂質の類似体を合成するバイオコンビナトリアル合成法を用いた糖脂質GM3(NeuAca2-3Galβ1-4Glcβ1-Cer)類似体の生産における最適条件を詳細に検討した。アルキル鎖の根元にアジド基を導入した糖鎖プライマーは他のプライマーと比べて約2倍糖鎖伸長を受けやすいことが明らかとなったが、プライマーの界面活性能を測定することによりこの理由も明らかにした。また、播種細胞数依存性、プライマー濃度依存性、培養時間依存性についても明確な依存性を確認し、最適条件を決定した。さらに、検討した最適条件を用いてのGM3類似体の大量合成と、生成物の分離精製方法も検討した。次に、GM3とepidermal growth factor receptor(EGFR)の相互作用や細胞における外因性/内在性GM3について検証した。GM3とEGFRの相互作用の機序を、共焦点レーザー顕微鏡による画像解析など様々な手法により明らかにした。さらに、GM3の代謝中間体であるlyso-GM3のオリゴマー化、合成された化合物のキナーゼ活性への阻害効果や細胞毒性を評価した。EGFRを高発現しているA431細胞に各化合物を様々な濃度で添加したところ、lyso-GM3 dimerに高いチロシンキナーゼ活性阻害能が見出された。大量合成の可能性が示されたGM3類似体(lyso-GM3 mimetic)を応用して同様な機能性糖鎖含有分子の合成を行い、それらがEGFRの関係する生理現象に及ぼす作用を検証した。A431細胞にこれらの各々の化合物を投与し、糖鎖伸長したプライマーを応用した新規化合物であるmimetic dimerに天然型であるlyso-GM3 dimerと同様のEGFRのチロシンリン酸化阻害能があることを示した。さらに、EGFRシグナリングの下流にあたるAktや細胞増殖も抑制することを明らかにした。EGFRとGM3の直接的相互作用を、SPR法を用いて詳細に解析した。結合定数やkinetics parameterの解析により、EGFRと糖脂質の相互作用が特異的であることを発見した。

The optimum conditions for the production of glycolipid GM3 (NeuAca2-3Galβ1-4Glcβ1-Cer) analogues were discussed in detail. The reason why the sugar chain is active is that the sugar chain is about 2 times longer than the sugar chain. Dependence on the number of seeding cells, concentration, culture time, and determination of the optimum conditions In this paper, the optimum conditions for mass synthesis and purification of GM3 analogues are discussed. Next, GM3 and epidermal growth factor receptor(EGFR) interaction and cellular pathogenesis of exogenous/intrinsic GM3 The mechanism of interaction between GM3 and EGFR is discussed in detail below. In addition, the metabolic intermediates of GM3 were evaluated for their catalytic activity and cytotoxicity. EGFR is highly expressed in A431 cells, and inhibition of EGFR activity is observed at various concentrations of various compounds added to lyso-GM3 dimer. The possibility of mass synthesis has been demonstrated for the use of lyso-GM3 mimetics, for the synthesis of similar functional glycan containing molecules, and for the identification of physiological phenomena and interactions related to EGFR. A431 cells were treated with various compounds, and the glucolock elongation was determined by using new compounds, namely mimetic dimer, natural lyso-GM3 dimer, and EGFR. Akt cell proliferation inhibition in the downstream of EGFR EGFR GM3 direct interaction analysis using SPR method The interaction between EGFR and glycolipid is unique to the analysis of binding parameters and kinetics parameters.

项目成果

期刊论文数量（6）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

新規なlyso-GM3オリゴマーの合成とEGF受容体キナーゼ活性の阻害能の評価

新型 lyso-GM3 寡聚物的合成及其抑制 EGF 受体激酶活性的能力评估

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
室塚淑美;畑中研一;箱守仙一郎
通讯作者：
箱守仙一郎

細胞を用いる糖鎖生産

使用细胞生产聚糖

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
化学と生物(日本農芸化学会) 46
影响因子：
0
作者：
S. Nakano;L. Wu;H. Oka;H. T. Karimata;T. Kirihata;Y. Sato;S. Fujii;H. Sakai;M. Kuwahara;H. Sawai;N. Sugimoto;畑中研一
通讯作者：
畑中研一

Quantitaive Analysis of EGFR Affnity to Immobilized Glycolipids by Surface Plasmon Resonance

通过表面等离子共振定量分析 EGFR 对固定化糖脂的亲和力