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新世代エキソサイトーシス光学プローブの開発

新一代胞吐光学探针的研制

基本信息

批准号：
19659051
负责人：
八尾寛
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

VAMP-pHluorin(シナプトフルオリン)は、pH感受性GFP改変タンパク質であるpHluorinを、シナプス小胞膜タンパク質であるVAMP-2(Synaptobrevin-2)のC末端側に融合させたものである。シナプス小胞内腔のpHは、エキソサイトーシス、エンドサイトーシスなどの過程で酸性(pH 5.6)→中性→酸性に変化する。VAMP-pHluorinの蛍光変化により、小胞ダイナミクスをリアルタイムに可視化するのが、シナプトフルオリン法である。従来の方法に比べ、シナプトフルオリン法によるエキソサイトーシス計測は高い感度を有しているといえる。しかし、(1)神経活動の際、内因性物質であるフラボンタンパク質(FAD)などに由来する自家蛍光がVAMP-pHluorinのS/Nを低下させる、(2)酸性環境におけるpHluorinの蛍光が微弱であり、VAMP-pHluorinを発現している終末を非活動時に形態的に同定するのが難しい、といった問題点が残されていた。造礁サンゴのDiscosoma種由来の蛍光タンパク質DsRedの改変体モノマーのひとつmOrangeは、pHluorinよりも長波長側に励起蛍光波長を持つ。本研究では、mOrangeのpH感受性を蛍光分光光度計で計測し、pKaを求めた。得られたpKaは7.1であり、mOrangeを用いることにより、S/Nが改良される可能性が示唆された。さらに、黄色蛍光タンパク質EYFPをドナー、mOrangeをアクセプターとするFRETによるレシオ型pHセンサーの作成を試みた。しかし、期待通りのFRETを得るには、リンカー部分の改善がさらに必要である。しかしVAMP-mOrange単独であっても、S/Nに改善が期待されるので、これを検証する目的で、VAMP-mOrangeをゲノムに導入したPC12細胞のin vivoの分泌システムを構築した。

VAMP-pHluorin ( The pH of the cell interior changes from acidic (pH 5.6) to neutral to acidic. VAMP-pHluorin light conversion, cell selection, and visualization In the past, the method of measuring high sensitivity was compared with the method of measuring high sensitivity. (1) The S/N ratio of VAMP-pHluorin is low due to the intrinsic substance during the activity of the brain;(2) The S/N ratio of VAMP-pHluorin is low due to the intrinsic substance during the activity of the brain;(3) The S/N ratio of VAMP-pHluorin is low due to the intrinsic substance during the activity of the brain;(4) The S/N ratio of VAMP-pHluorin is low due to the intrinsic substance during the activity of the brain;(5) The S/N ratio of VAMP-pHluorin is low due to the intrinsic substance during the activity of the brain;(6) The S/N ratio of VAMP-pHluorin is low due to the intrinsic substance during the activity of the brain;(7) The S/N ratio of VAMP-pHluorin is low due to the intrinsic substance during the activity of the brain;(8) The S/N ratio of VAMP-pHluorin is low due to the intrinsic substance during the activity of the brain. The origin of the Discosoma species in the reef is the light source of the substance DsRed, which is modified by the wavelength of the excitation light. In this study, the pH sensitivity of orange was measured by spectrophotometry. The probability of obtaining pKa 7.1, mOrange and S/N is shown. In addition, the yellow light source can be used to detect the presence of EYFP, mOrange and FRET. We hope that the FRET will be improved. VAMP-mOrange must be introduced into PC12 cells to construct in vivo secretion systems for the purpose of improving S/N ratio.