RT-PCR法によるHGF-mRNAの定量と局在

RT-PCR 方法对 HGF-mRNA 进行定量和定位

• 批准号: 07670022
• 负责人: 和佐野 公二郎
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07670022/
• 关键词: ラットHGF; ノーザンブロット; インサイツハイブリダイゼーション; ジコキシゲニン; 肺; 器官形成

ラット肝細胞成長因子(HGF)のcDNA塩基配列308-328と606-626に一致する上流、下流プライマーを設計、ラット肝よりオリゴdT精製したmRNAを鋳型にRT-PCR(逆転写-ポリメラ-セ鎖反応)を行い期待どうりの分子量318塩基対の産物を得た。PCR産物内部のEcoRI, Avall制限酵素切断解析により期待どうりの塩基対断片を得、PCRが正確にHGFの狙ったシークエンスを読んでいることを確認した。このPCR産物をpCR-scriptベクターに挿入、XL-1blueをtransformし、青白選択後、菌株を増殖、plasmidをSDS-NaOH-PEG法にて精製した。精製plasmidを煮沸変性後、上述のプライマーセットを用いPCRを行い挿入物の存在保持をアガロース泳動にて再確認した。pCR-scriptマルチクローニングサイト両端に組み込まれたBssHIIサイトを切断し、切断断片をさらにAvaIIで切断、インサートのさし込み方向を決定した。分析したすべてのコロニーにおいてインサートはすべて+-逆転して挿入されていた。次に、digoxygenin-UTP標識antisenseRNAを得るためベクター下流の5′末端突出させるHindIIIサイトを切断、上流のT3RNApolymerase promotorよりdig-UTPラベリングミックスを用いdigラベル-antisenseRNAを生成させた。フォルムアルデヒド変性アガロース泳動にて産物を確認した後、陽性ナイロン膜にスポットし抗dig-alkphase抗体染色、発色させ、digのさし込みを確認した。このdig-RNAプローブを用い周産期ラット肺から抽出したtotal RNAをノーザンブロットし、HGF-mRNAの定量を行った。その結果HGF-mRNAは生後21-28日に高い値で検出された。このデータはKagoshima等(Eur. J. Biochem210 : 375)の所見と良く一致した。生後の肺の組織改築が21日頃に終了するが、その後の1週間にHGFが多量に生成される可能性が示された事は肺におけるHGFの役割、または非肝臓性のHGFの機能を考えるうえで興味深い。今後は、このプローブを用いHGF産製細胞の同定のためにin situ hybridizarionを行っていく。

ラ ッ ト hepatocyte growth factor (HGF) の cDNA salt base と go up 308-328 606-626 に consistent す る upper-class, obscene プ ラ イ マ ー を design, ラ ッ ト liver よ り オ リ ゴ dT refined し た mRNA を type where に rt-pcr (inverse planning write - ポ リ メ ラ - セ lock anti 応) line を い expect ど う り の molecular weight 318 salt base polices The product を gives た. PCR products internal の EcoRI, limitations Avall enzyme cut parsing に よ り expect ど う り の salt base ain を, PCR fragment が right に HGF の previously っ た シ ー ク エ ン ス を 読 ん で い る こ と を confirm し た. を PCR こ の PCR products - script ベ ク タ ー に scions into blue, XL - 1 を transform し, stimulation, sentaku, strain を raised after colonization, plasmid を SDS - NaOH - PEG method に て refined し た. Refined plasmid を boil - after sex, the above の プ ラ イ マ ー セ ッ ト を with PCR line を い い scions into の exist to keep を ア ガ ロ ー ス swimming に て reconfirm し た. PCR - script マ ル チ ク ロ ー ニ ン グ サ イ ト struck the に group み 込 ま れ た BssHII サ イ ト を cut し, cut off the fragment を さ ら に AvaII で cut, イ ン サ ー ト の さ し 込 み direction を decided し た. Analysis し た す べ て の コ ロ ニ ー に お い て イ ン サ ー ト は す べ て + - inverse planning し て scions into さ れ て い た. The に, digoxygenin-UTP identifier antisenseRNAを るためベ タ タ downstream <s:1> 5 'end protrudes させるHindIIIサ トを トを cut off upstream <s:1> T3RNApolymerase Promotor よ り dig - UTP ラ ベ リ ン グ ミ ッ ク ス を with い dig ラ ベ ル - antisenseRNA を generated さ せ た. フ ォ ル ム ア ル デ ヒ ド - sex ア ガ ロ ー ス swimming に て product を confirm し after た, positive ナ イ ロ ン membrane に ス ポ ッ ト し resistance to dig alkphase antibody staining, 発 さ せ, dig の さ し 込 み を confirm し た. こ の dig - RNA プ ロ ー ブ を with い foreign-born ラ ッ ト lung か ら spare し た total RNA を ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト し, HGF - mRNA の quantitative を line っ た. Youdaoplaceholder0 そ results: HGF-mRNA に is at a に high そ value 21-28 days after birth で検 された. こ の デ ー タ は Kagoshima, etc. (Eur. J. Biochem210:375) good と く の see consistent し た. Raw built が の の lung tissue change after 21 hectares of に end す る が, そ の の after 1 week between に HGF が に generated abundant さ れ が る possibility in さ れ た matter は lung に お け る HGF の cut, ま た は non routine liver の HGF を の function test え る う え で tumblers deep い. Future は, こ の プ ロ ー ブ を with い HGF production cell の with fixed の た め に in situ hybridizarion を line っ て い く.