ES細胞由来表皮ケラチノサイトを用いた表皮性POU転写因子Skn-1nの機能解析

使用 ES 细胞来源的表皮角质形成细胞进行表皮 POU 转录因子 Skn-1n 的功能分析

• 批准号: 14657197
• 负责人: 玉井 克人
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Hirosaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657197/
• 关键词: ES細胞; 骨髄細胞; 線維芽細胞; 転写因子; SCIDマウス

研究実績の概要(1)複数の表皮性遺伝子230kD類天疱瘡抗原(BPAG1)プロモーターにネオマイシン耐性遺伝子とGFP遺伝子を直列に接続したプラスミドコンストラクトを作成し、ES細胞染色体に組み込んで形質転換株を作成した。(2)形質転換したESと胎児皮膚線維芽細胞を共培養し、GFPの発現を検討した結果、線維芽細胞と共培養した系においてGFPの発現する割合が多い傾向を示した。(3)(1)で組み込んだネオマイシン添加培地で培養することにより、表皮性遺伝子であるBPAG1プロモーターが発現するES細胞を選択した。今後の研究計画(1)ES細胞培養開始時点から表皮ケラチノサイトへと形質転換する過程で経時的にRNAを採取し、Skn-1nの発現時期、発現量の推移をノーザンブロット、RT-PCRで検討する。(2)相同組換えを用いてSkn-1n遺伝子をノックアウト(Skn-1n-/-)したES細胞を作成し、外胚葉や表皮ケラチノサイト形成に及ぼす影響を検討する。(3)Skn-1n-/-ES細胞にテトラサイクリンによるSkn-1n誘導系を導入し、ESから表皮ケラチノサイトに至る種々の時期にSkn-1nの発現を誘導することにより、Skn-1nの表皮形成における役割を検討する。(4)上記の解析を通じ、外胚葉系細胞から表皮形質が出現する時期をGFP発現のモニターにより明らかにし、その前後の細胞における表面形質を検討することにより、表皮幹細胞特異的な表面形質を決定する。(5)決定した表皮幹細胞特異的表面形質を基に、表皮幹細胞単離方法を確立する。(6)表皮幹細胞出現前後における転写因子のプロフィールをDNAチップ、あるいはRNAサブトラクション法により検討し、表皮ケラチノサイト発生のためのマスターレギュレーターを解析する。

Summary of the results of the study (1) The 230kD pemphigoid antigen (BPAG1) of multiple epidermal genes was prepared by in-line connection between the resistance gene and the GFP gene, and the chromosome of ES cells was prepared by in-line hybridization. (2)The results showed that there was a tendency for GFP expression in co-culture of embryonic skin cells and embryonic cells. (3)(1) Selection of ES cells from which BPAG1 can be developed by adding culture medium to culture medium. Future research projects (1) Study of RNA extraction, Skn-1n development period, development amount transition, and RT-PCR during the process of ES cell culture initiation from epidermal growth to morphological transformation. (2)The effects of the same composition on the formation of ES cells, the formation of ectoderm and epidermis were discussed. (3)Skn-1n-/-ES cells were introduced into SKn-1n induction line, and SKn-1n induction and SKn-1n cuticulation were discussed during the period from ES to ES. (4)The analysis of the above information indicates that the expression of GFP in ectodermal cells is determined by the surface morphology of cells before and after the appearance of epidermal morphology. (5)To determine the specific surface characteristics of epidermal stem cells, epidermal stem cell isolation methods were established. (6)Before and after the emergence of epidermal stem cells, the expression of genes and RNA was analyzed.

项目成果

Nakamura H, Aoki M, Tamai K, Oishi M, Ogihara T, Kaneda Y, Morishita R: "Prevention and regression of atopic dermatitis by ointment containing NFkB decoy oligonucleotides in NC/Nga atopic mouse model"Gene Therapy. 9. 1221-1229 (2002)

Nakamura H、Aoki M、Tamai K、Oishi M、Ogihara T、Kaneda Y、Morishita R：“在 NC/Nga 特应性小鼠模型中通过含有 NFkB 诱饵寡核苷酸的软膏预防和消退特应性皮炎”基因治疗。

Meng X, Sawamura D, Ina S, Tamai K, Hanada K, Hashimoto I: "Keratinocyte gene therapy : cytokine gene expression in local keratinocytes and in circulation by introducing cytokine genes into skin"Exp Dermatol. 11. 456-461 (2002)

Meng X、Sawamura D、Ina S、Tamai K、Hanada K、Hashimoto I：“角质形成细胞基因疗法：通过将细胞因子基因引入皮肤，在局部角质形成细胞和循环中表达细胞因子基因”Exp Dermatol。

Matsuzaki Y, Tamai K, Kon A, Sawamura D, Uitto J, Hashimoto M: "Keratinocyte responsive element 3 (KRE3) : Analysis of a keratinocyte-specific regulatory sequence in the 230-kD bullous pemphigoid antigen (BPAG1) gene promoter"J Invest Dermatol. 120. 308-3

Matsuzaki Y、Tamai K、Kon A、Sawamura D、Uitto J、Hashimoto M：“角质形成细胞反应元件 3 (KRE3)：230-kD 大疱性类天疱疮抗原 (BPAG1) 基因启动子中角质形成细胞特异性调控序列的分析”J