染色体部位特異的遺伝子導入法開発と表皮水疱症遺伝子治療への応用

染色体位点特异性基因转移方法的开发及其在大疱性表皮松解症基因治疗中的应用

• 批准号: 18659324
• 负责人: 玉井 克人
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659324/
• 关键词: 遺伝子相同組み換え; VII型コラーゲン; 遺伝子治療; BACクローン; トランスボゾン

表皮水庖症を始めとする遺伝性疾患の根治的治療を可能にするためには、標的細胞の遺伝子異常部位を正常復帰させる新たな方法論の開発が必要である。我々は、以下の3つの方法論をデザインし、その遺伝子組み換え効率に関する検討を進めた。1)BACクローンを用いた高効率遺伝子組み換え法の確立:VII型コラーゲン遺伝子COL7A1領域を含むbacterial artificial chromosome (BAC)クローンを用いてCOL7A1の3'および5'末端側のそれぞれに約20kbのアームを持ったCOL7A1組み換え用BACベクターを作成した。これを用いてCOL7A1ノックアウトマウス由来の種々の細胞におけるCOL7A1領域の組み換え効率検討を進めた。2)トランスポゾンを持つ遺伝子発現ベクターの高効率DNA組み換え能を利用し、1)で作成したBAC由来COL7A1組み換えベクター内にトランスポゾン配列を挿入し、相同組み換え効率向上の可能性を検討した。3)マウス線維芽細胞株NIH3T3にGFP-EcoRI-Puro発現プラスミドベクターを導入し、ピューロマイシン存在下に培養して染色体内に安定的にプラスミドが組み込まれた細胞を選択した。次にこの細胞よりDNAを抽出し、種々の制限酵素で切断した後に、GFPおよびEcoRI配列をそれぞれ含むプライマーDNAを用いてPCRを施行し、増幅されたDNA断片の塩基配列を決定することにより、染色体内の挿入部位の同定を進めた。高頻度に遺伝子組み換えが起き、かつ遺伝子間の非機能領域にあることが予想される部位を同定し、同領域を含むBACクローンを用いて1)および2)の方法を応用した高効率相同組み換え法の開発を進めた。

为了使遗传疾病（例如表皮植物病）的遗传疾病进行根本性治疗，有必要开发新的方法来恢复靶细胞中正常基因异常部位。 We designed the following three methodologies and investigated their genetic modification efficiency: 1) Establishment of a highly efficient genetic recombination method using a BAC clone: ​​A BAC vector for recombination for COL7A1 with approximately 20 kb arms on each of the 3' and 5' ends of COL7A1 was created using a bacteria artificial chromosome (BAC) clone containing the COL7A1 type VII collagen gene COL7A1 region.使用它，我们研究了Col7a1敲除小鼠的各种细胞中Col7a1区域的重组效率。 2）使用载有转座子的基因表达载体的高效DNA重组能力，将转座子序列插入1）中创建的BAC7A1重组载体中，以检查提高同源重组效率的可能性。 3）将GFP-ECORI-PURO表达质粒载体引入到小鼠成纤维细胞系NIH3T3中，并在呼毒素存在下培养以稳定地整合到染色体中的细胞中。接下来，从这些细胞中提取DNA，用各种限制酶裂解，然后使用含有GFP和ECORI序列的引物DNA进行PCR，并确定放大DNA片段的碱基序列，从而识别染色体内的插入位点。我们确定了预计会经常发生并在基因之间的非功能区域中进行的位点，并使用方法1）和2）使用包含同一区域的BAC克隆开发了一种高效的同源重组方法。

项目成果

Needleless intranasal administration of HVJ-E containing allergen attenuates experimental allergic rhinitis.

无针鼻内施用含有过敏原的 HVJ-E 可减轻实验性过敏性鼻炎。

• 发表时间: 2007
• 期刊: J Mol Med (In press)
• 作者: Yasuoka E;Oshima K;Tamai K;Kubo T;Kaneda Y.
• 通讯作者: Kaneda Y.

Interferon-gamma down-regulates expression of the 230-kDa bullous pemphigoid antigen gene (BPAG1) in epidermal keratinocytes via novel chimeric sequences of ISRE and GAS

干扰素-γ 通过 ISRE 和 GAS 的新型嵌合序列下调表皮角质形成细胞中 230 kDa 大疱性类天疱疮抗原基因 (BPAG1) 的表达

• 发表时间: 2006
• 期刊: Exp Dermatol 15
• 作者: Kakizaki I;Takahashi R;Ibori N;Kojima K;Takahashi T;Yamaguchi M;Kon A;Takagaki K;Kondo N;Yamaguchi M;Morohashi H;Kaneko T
• 通讯作者: Kaneko T