ES細胞から分化する表皮幹細胞の新しい同定法の確立

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今回、我々はES細胞から表皮幹細胞を分化させ、その細胞の性質や機能を解析する研究を企画した。そこで、表皮幹細胞に相当する、未分化状態の細胞集団を得るために以下のような新しい方法を企画した。表皮幹細胞のマーカーと考えられるケラチンK19のプロモーターの下流に、K14とgreen fluorescence protein (GFP)を融合した遺伝子を構築する。その遺伝子を組み込んだES細胞を作成する。その細胞からembryoid bodyやES tumorを作成し、GFPの蛍光を持ち、かつ表皮幹細胞に特有のケラチンネットワークが認められた細胞を同定する。K19は表皮幹細胞のマーカーであるが、膵臓や肝臓などでも発現される。そこで、表皮特異的なK14の発現パターンをたよりに表皮幹細胞を見出す計画であった。今年度、融合蛋白発現コンストラクトを作成した。即ち、マウスケラチンK19遺伝子のプロモーターの塩基配列が報告されているので、一部をPCRにて増幅する。それをプローブとしてマウスのgenomic libraryをスクリーニングし、K19の発現を正確に再現できる長さ(約5kb)のプロモーターを含むクローンを単離した。マウス表皮細胞cDNAからマウスK14 cDNAをPCRにて増幅し、フレームを合わせてその下流にGFP遺伝子を繋ぐ。そして、その融合蛋白の遺伝子をK19プロモーター下流に加えた。できた遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミッドに挿入し、K19-K14-GFPを作成した。次に、ES細胞を未分化な状態で培養する。K19-K14-GFPをES細胞D3にelectroporation法にて導入し、ネオマイシン耐性遺伝子をたよりにG418にて、K19-K14-GFPが染色体に組み込まれた細胞を選択した。今後、Embryoid bodyとES tumorの作成し、GFP陽性細胞を解析する予定である。