D-アミノ酸からなる機能性スモールプロテインのコンビナトリアル創製

由 D-氨基酸组成的功能性小蛋白的组合创造

• 批准号: 14658189
• 负责人: 森井 孝
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658189/
• 关键词: タンパク質デザイン; D-アミノ酸; ケミカルライブラリー; コンビナントリアル・ケミストリー; DNA認識; 分子認識; ライブラリー; コンビナトリアル・ケミストリー

任意のDNA塩基配列を認識しうるD-スモールプロテインを得るために、(1)DNAを認識するD-アミノ酸からなるヘリックス中(約20アミノ酸)の同一表面に存在することが期待される5アミノ酸をランダム化し、第一段階のD-オリゴペプチドライブラリーとする、(2)セカンドサブユニットとして、すでにどのようなDNA塩基配列に適合するかが明らかになっているもう一つの認識ヘリックスと二量体形成部位を導入することにより、異種二量体としてDNA結合能を有する機能性スモールプロテインライブラリーに変換する、(3)このライブラリーを目的とするDNA配列に対してスクリーニングし、目的とする塩基配列を認識するD-ペプチド配列を決定する、という戦略をたてた。ロイシンジッパータンパク質GCN4のDNA認識ヘリックスを基にStructure-based Designを行い、DNA塩基配列の認識に関わると考えられる5箇所のアミノ酸をそれぞれアラニン、アルギニン、スレオニン、アスパラギン、セリンを用いてランダム化したD-ペプチドライブラリーを構築した。このライブラリーに対して天然型GCN4ペプチド(23アミノ酸)をセカンドサブユニットとして用いてジスルフィド結合により化学修飾し、DNAとの親和性を高めた後、特定のDNA配列に対する結合を指標としてスクリーニングを行い、目的の塩基配列を認識するD-ペプチド配列を決定することを試みた。天然のGCN4が認識するDNA配列に対してランダム化したL-ペプチドライブラリーを用いてスクリーニングしたところ、ほぼ天然のものと同じアミノ酸配列が得られることがわかったことから、この戦略の妥当性が示された。現在D-ペプチドライブラリーを用いて、スクリーニングを行っている。

In order to obtain a D-small protein that can recognize any DNA base sequence, we established a strategy: (1) randomize five amino acids (approximately 20 amino acids) in a helix consisting of DNA-recognizing D-amino acids, which are expected to be present on the same surface, and make it the first stage D-oligopeptide library, (2) introduce another recognition helix and a dimer formation site as a second subunit, which has已经被鉴定为匹配DNA碱基序列，并将其转换为具有DNA结合能力作为异源二聚体的功能性小蛋白质库，（3）筛选该库的目标DNA序列并确定识别目标碱基序列的D肽序列。基于结构的设计是基于亮氨酸拉链蛋白GCN4的DNA识别螺旋进行的，并构建了D肽库，其中分别使用丙氨酸，精氨酸，三氨酸，亚帕拉金和丝氨酸，其中五个氨基酸被认为参与了DNA碱基识别的识别DNA碱基序列。该文库通过使用天然GCN4肽（23个氨基酸）作为第二个亚基来化学修饰该文库，以增加与DNA的亲和力，然后使用与特定DNA序列的结合作为指数进行筛选，以确定识别所需碱基序列的D肽序列。使用天然GCN4识别的DNA序列的随机L肽库进行筛选显示了该策略的有效性，因为它发现氨基酸序列与天然的序列几乎相同。目前正在使用D肽库进行筛查。

项目成果

T.Morii: "Functional Reassembly of a Split Ph Domain"J.Am.Chem.Soc.. 124. 5000-5004 (2003)

T.Morii：“分裂 Ph 结构域的功能重组”J.Am.Chem.Soc.. 124. 5000-5004 (2003)

T.Morii: "Functional Reassembly of a Split PH Domain"J. Am. Chem. Soc.. 124(in press). (2003)

T.Morii：“拆分 PH 结构域的功能重组”J。

T.Morii: "In Vitro Selection of ATP-binding Receptors Using a Ribonucleopeptide Complex"J. Am. Chem. Soc.. 124. 4617-4622 (2002)

T.Morii：“使用核糖核酸肽复合物体外选择 ATP 结合受体”J。

T.Morii: "A New Fluorescent Biosensor for Inositol Trisphosphate"J. Am. Chem. Soc.. 124. 1139-1140 (2002)

T.Morii：“一种新型肌醇三磷酸荧光生物传感器”J。

T.Morii: "Chemical Approach to Untangle the Sequence-Specific DNA Binding by Proteins"Chem-Eur. J.. 22. 5067-5071 (2002)

T.Morii：“解开蛋白质序列特异性 DNA 结合的化学方法”Chem-Eur。