三次元構造をもとにしたミニチュアメタン酸化酵素の創製

基于三维结构的微型甲烷氧化酶的研制

• 批准号: 19651092
• 负责人: 森井 孝
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19651092/
• 关键词: メタンモノキシゲナーゼ; タンパク質工学; 鉄錯体; メタン酸化; タンパク質フォールディング; ミニチュアタンパク質; バイオエネルギー; 立体構造デザイン; メタンモノオキシゲナーゼ

タンパク質酵素は天然の状態では不安定なものが多く、扱いが困難である。本研究では、安定なタンパク質酵素単量体を作製するために、これまでほとんど考慮されていないタンパク質表面の改変に注目した。タンパク質の立体構造を変えることなくタンパク質表面を改変し、安定に折りたたまれる単量体タンパク質を設計する方法論を確立するため、本研究では、メタンモノオキシゲナーゼの構成ユニットであるメタンハイドロキシラーゼ(MMOH)を構成する6量体のうち、MMOHの活性部位を含むαサブユニットをもとにして単量体かつ安定なミニチュアメタン酸化酵素を作製することを目的とした。そのため、(1)MMOHαサブユニットN末端とC末端の内、立体構造形成に関与が少ないと思われる部位を削除し、分子量を下げた。次に、(2)表面残基のうち疎水性パッチを形成している部位に着目し、タンパク質立体構造データベースからその部位と類似した三次元構造を探索し、探索された構造の親水性表面をMMOHαサブユニットに移植することでMMOHαサブユニット可溶性の増大を図った。立体構造データベースから探索した親水性の表面構造を移植したαサブユニット変異体群は大腸菌発現系において不溶性画分に発現した。この画分から各変異体を単離・精製し、希釈によるリフォールディングを試みところ、いくつかの変異体は中性pHにおいても可溶化することが分かった。また、いくつかの可溶性αサブユニット変異体について、Co(II)イオンの配位と円二色性スペクトルの解析による立体構造形成が確認された。本研究の成果により、多量体タンパク質酵素のサブユニットをもとにして、タンパク質表面を改変することにより、安定な単量体タンパク質が構築できる可能性が示された。

The natural state of the enzyme is unstable and difficult. In this study, we focused our attention on the improvement of the quality of the enzyme. A methodology was established for the qualitative design of a solid structure. In this study, the qualitative surface was modified, stabilized, and the qualitative design of a solid structure was established. The active site of MMOH contains a stable enzyme. (1)MMOHα2) The surface residues of the hydrophilic surface of the MMOH α were found to be soluble in water, and the solubility of the MMOH α was increased. The three-dimensional structure of the surface structure of the hydrophilic group was discovered in the development of Escherichia coli. The difference between the two is that they are different in pH and soluble in water. The formation of the three-dimensional structure was confirmed by the analysis of Co (II), Co(II), Co(II) and Co(II). The results of this study demonstrate the possibility of improving the quality and stability of a single enzyme.

项目成果

単量体メタン水酸化酵素の分子設計

单体甲烷羟化酶的分子设计

• 发表时间: 2007
• 作者: 藤枝伸宇;井上雅文;龍山裕一;森井孝
• 通讯作者: 森井孝

最小構造からなる単量体メタン水酸化酵素の分子設計(1)

最小结构单体甲烷羟化酶的分子设计 (1)

• 发表时间: 2008
• 作者: 藤枝伸宇;井上雅文;龍山裕一;森井孝
• 通讯作者: 森井孝

Structure-based design of soluble miniature methane monooxygenase hydroxyylase

可溶性小型甲烷单加氧酶羟化酶的结构设计

• 发表时间: 2008
• 作者: 藤枝伸宇;森井孝
• 通讯作者: 森井孝

最小構造からなる単量体メタン水酸化酵素の分子設計(2)

最小结构单体甲烷羟化酶的分子设计 (2)

• 发表时间: 2008
• 作者: 龍山裕一;藤枝伸宇;井上雅文;森井孝
• 通讯作者: 森井孝