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全真核細胞に適用可能な新規遺伝子破壊法の開発

开发适用于所有真核细胞的新基因破坏方法

基本信息

批准号：
14658220
负责人：
関政幸
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658220/
关键词：
Xenopus Eggs Extract RAD51 RAD54 RECQL4 BRC4 ノックアウト RPA

项目摘要

本研究では、試験管内で様々に加工した二本鎖DNA/組換えタンパク質RAD51を調製し、それを核の標的遺伝子座にターゲットインテグレーションさせる新規遺伝子破壊法の確立を目指した。実際には、カエル精子をカエル卵抽出液中で反応させて構築した核を標的として、全ての反応を試験管内で完結できるようにした。残念ながらRAD51の調製に難航し、最終的なジーシターゲッティングの成功までには至らなかったが、試験管内で以下の相同組換え反応を再現できた。1)反応系にEcoRIを加えて精子DNAに二重鎖切断(DSB)を導入したところ、RPAが集積し、さらにはRAD51が精子核にリクルートされた。2)さらにRAD51が集積した近辺でgemininに耐性のDNA合成、すなわちDNA修復合成活性を見いだした(J.Cell.Sci.,2002)。3)ここで抽出液からRPAを除去すると、EcoRIで形成されたDSBにRAD51がリクルートされないことを証明した。4)一方RAD51の反応をBRC4を添加して阻害すると、EcoRI誘導のRAD51のクロマチンへの結合が阻害された。この条件下でRPAのクロマチンへの結合はBRC4の有り無しで影響を受けないが、ヒト早老症ロスムンドートムソン症候群原因産物RECQL4のEcoRIで誘導されるクロマチン結合は有意に減少した。逆にRECQL4を反応液から枯渇させるとEcoRI誘導RAD51のクロマチンへの結合速度が遅れた。5)さらにRECQL4の枯渇とBRC4添加によるRAD51の阻害をいっぺんに行うとEcoRIによって生じたDSBのDNA修復合成に必要と考えられるDNAポリメラーゼαのクロマチンへの結合が消失した。以上の本研究を通じ、カエル卵抽出液中で相同組換え反応を解析できることを立証し、ジーンターゲッティングを試験管内で再構成するための実験系を提示できた。

In this study, we established a new method of DNA sequencing for the detection of DNA fragments in the target loci of DNA fragments. In the meantime, the sperm extract was used to construct the nuclear target, and the whole sperm extract was used to complete the test. The last step is to modify RAD51, and the final step is to reproduce the same combination of components in the test tube. 1)In the reverse system, EcoRI was added to the sperm DNA double lock cleavage (DSB), and RPA was added to the sperm nucleus. 2) RAD51 has been found to accumulate geminin tolerance DNA synthesis and DNA repair activity (J.Cell.Sci., 2002)。3) RPA is removed from the extract and EcoRI is formed. 4)The addition of RAD51 to BRC4 and the combination of RAD51 to EcoRI are both harmful. Under these conditions, the binding of RPA to BRC-4 was induced by EcoRI, the causative product of premature aging syndrome. RECQL4 is a reactive medium, and EcoRI induces RAD51 to bind at a faster rate. 5) Add RECQL4 and BRC4 to RAD51 to prevent DNA damage. EcoRI is necessary for DNA repair. In this study, the same composition of the extract solution was analyzed, and the results showed that the composition of the extract solution was similar to that of the extract solution.