权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

誘導型NO合成酵素のcDNAクローニングと血管での発現

诱导型NO合酶的cDNA克隆及其在血管中的表达

基本信息

批准号：
04670532
负责人：
由井芳樹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04670532/
关键词：
EDRF NO 血管弛緩内皮細胞 cDNA クローニング NO合成酵素

项目摘要

ラット腹腔の活性化マクロファージからNO合成酵素の誘導型の蛋白を均一に精製した。この蛋白質をリシルエンドペプチダーゼAP-Iで分解処理しペプチドを逆相HPLCで分離、分取した。ペプチドを473A(AB社)ペプチドシーケンサーで解析し各ペプチドのアミノ酸配列を決定しデータベースでホモロジー検索を行ったが既知のペプチドとのホモロジーはなかった。上記のペプチドに対するDNAプローブをDNA合成した。活性化マクロファージからCaCl法によりRNAを作成し更にmRNAを精製した。このmRNAからoligo dTをプライマーとしてcDNAをつくりλgt10でcDNAライブラリーを作成した。PCR法により先の合成DNAから300-500bpsのDNAを合成しランダムブリング法により^<32>Pラベルした。このラベルしたDNAをプローブにしてcDNAライブラリーからスクリーニングし陽性クローンを得た。さらに他のプローブを用いてスクリーニングし最終的に1クローンを得た。M13にこのクローンをサブクローンしcDNA塩基配列を決定した。次にこのcDNAを発現ベクターPC DM8に組み込みCOS7細胞にtransfectionし本酵素の発現を検討した。COS7細胞を破壊後本酵素活性を測定すると酵素活性が測定できた。次にこの酵素の制御を検討した結果Ca^<++>は必要であったがcalmodulinは必要としなかった。

Homogeneous purification of inducible protein of NO synthase The protein was separated and separated by RP HPLC. Select a page 473A(AB) Select a page to determine the acid allocation of each page. Note that the DNA synthesis of the above mentioned proteins The activation of RNA and the purification of mRNA This mRNA is called oligo and cDNA is called cDNA. PCR method for the synthesis of DNA from 300-500bps DNA <32>synthesis This is the first time that we've seen a DNA fragment that's been cloned into a DNA fragment. The last one was found in the box. M13 is the most important gene in human genome. The expression of this cDNA was detected in PCDM8 cells and the expression of this enzyme was investigated. The enzyme activity was measured after COS7 cells were broken. The result of this enzyme control is that it is necessary to regulate the activity of the enzyme.