誘導型NO合成酵素のcDNAクローニングと血管での発現

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ラット腹腔の活性化マクロファージからNO合成酵素の誘導型の蛋白を均一に精製した。この蛋白質をリシルエンドペプチダーゼAP-Iで分解処理しペプチドを逆相HPLCで分離、分取した。ペプチドを473A(AB社)ペプチドシーケンサーで解析し各ペプチドのアミノ酸配列を決定しデータベースでホモロジー検索を行ったが既知のペプチドとのホモロジーはなかった。上記のペプチドに対するDNAプローブをDNA合成した。活性化マクロファージからCaCl法によりRNAを作成し更にmRNAを精製した。このmRNAからoligo dTをプライマーとしてcDNAをつくりλgt10でcDNAライブラリーを作成した。PCR法により先の合成DNAから300-500bpsのDNAを合成しランダムブリング法により^<32>Pラベルした。このラベルしたDNAをプローブにしてcDNAライブラリーからスクリーニングし陽性クローンを得た。さらに他のプローブを用いてスクリーニングし最終的に1クローンを得た。M13にこのクローンをサブクローンしcDNA塩基配列を決定した。次にこのcDNAを発現ベクターPC DM8に組み込みCOS7細胞にtransfectionし本酵素の発現を検討した。COS7細胞を破壊後本酵素活性を測定すると酵素活性が測定できた。次にこの酵素の制御を検討した結果Ca^<++>は必要であったがcalmodulinは必要としなかった。