バイオプテリン結合活性をもつ新しい機能蛋白質群のcDNAクローニング
具有生物蝶呤结合活性的新功能蛋白组的 cDNA 克隆
基本信息
- 批准号:06670106
- 负责人:
- 金额:$ 1.54万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
- 财政年份:1994
- 资助国家:日本
- 起止时间:1994 至 无数据
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
我々は第一に,6R-BH_4結合アミノ酸配列のモチーフを既知の6R-BH4結合蛋白質(チロシン及びトリプトファン水酸化酵素や一酸化窒素合成酵素)のアミノ酸配列から予想して,数種類のオリゴヌクレオチドプローブを作成した。ラット脳,培養神経細胞から精製したポリA-RNAをナイロンメンブレンに転写し,これらのプローブを用いてローストリンジェンシーの条件でハイブリダイゼーションを行ったところ,数本の信号が得られた。そこでλgt-10,λgt-11を用いてcDNAライブラリーを作成し,6R-BH_4プローブを用いてプラークハイブリダイゼーションによるλgt-10ライブラリーのスクリーニングを行った。λgt-10ライブラリーから得られたクローンを順次シークエンスしているが,現在までに構造の判明したうちの第一のものは残念ながらBrain-TypeのNitric Oxide Synthase(NOS)と思われた。COS細胞を用いて発現させてみると6R-BH_4,Calmodulin/Ca^<2+>に依存したアルギニンから一酸化窒素(NO)の産成がみられた。しかしながら,NOSとクロスハイブリダイゼーションしたプローブはNOSそのものから取った塩基配列ではない。従って今後新しい塩基配列をコードするクローンが,我々の考案した6R-BH_4プローブによって分離される可能性が高いと思われる。現在もクローニング及びシークエンシングを続行中である。λgt-11ライブラリーについては,これを大腸菌に感染させた後ナイロンメンブレンに発現蛋白質を吸着させ,この蛋白質とトリチウムラベルした6R-BH_4との結合性をオートラジオグラムで検討する事によってスクリーニングを行った。しかしながら,トリチウムラベルは効率がおもわしくなく,また[^3H]6R-BH_4の精製回収にも多大な時間が必要とされるため実験回数に制限がかっており,今のところ有力なクローンは得られていない。
In this paper, we propose the first method to synthesize 6R-BH_4-binding protein, which is known as 6R-BH_4-binding protein, and several kinds of amino acid sequences. In culture, the A-RNA gene is purified and the gene is expressed in the cell. The λgt-10,λgt-11 are used to construct the 6R-BH_4 cDNA library. The λgt-10 cDNA library is used to construct the 6R-BH_4 cDNA library. Lambda gt-10 is the first step in the construction of Brain-Type Nitric Oxide Synthase(NOS). COS cells are dependent on the expression of 6-R-BH_4,Calmodulin/Ca^<2+>, and the production of NO in COS cells. No, no, no, no. No, no. In the future, the possibility of separation of new base pairs is high. Now, you're in the middle of something.λgt-11, λ gt-11, λ gt-1 How long does it take to refine R-BH_4? How long does it take to refine R-BH_4? How long does it take to control the number of cycles?
项目成果
期刊论文数量(12)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
T.Ikura: "cDNA cloning and expression of bovine endothelin converting enzyme" Biochem Biophys Res Commun. 203. 1417-1422 (1994)
T.Ikura:“牛内皮素转换酶的 cDNA 克隆和表达”Biochem Biophys Res Commun。
- DOI:
- 发表时间:
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:
- 通讯作者:
Y.Takagi: "Structural basis of G protein specificity of human endothelin receptors;a study with endothelinA/B chimeras" J Biol Chem. (in press). (1995)
Y.Takagi:“人内皮素受体 G 蛋白特异性的结构基础;内皮素 A/B 嵌合体的研究”J Biol Chem。
- DOI:
- 发表时间:
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:
- 通讯作者:
K.Koshimura: "Dopamine releasing action of 6R-erythro-tetrahydrobiopterin:analysis of its action site using sepiapterin" J Neurochem. 63. 649-654 (1994)
K.Koshimura:“6R-赤型四氢生物蝶呤的多巴胺释放作用:使用七蝶呤分析其作用位点”J Neurochem。
- DOI:
- 发表时间:
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:
- 通讯作者:
T.Shiraki: "Genetic transfer of endothelin converting enzyme activity to CHO-K1 cells:detection of positive cells by reverse hemolytic plaque assay" FEBS Lett. 351. 197-200 (1994)
T.Shiraki:“内皮素转换酶活性向 CHO-K1 细胞的基因转移:通过反向溶血斑测定检测阳性细胞”FEBS Lett。
- DOI:
- 发表时间:
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:
- 通讯作者:
T.Enoki: "Long-lasting activation of cation current by low concentration of endothelin-1 in mouse fibroblasts and smooth muscle cells of rabbit aorta" Br J Pharmacol. (in press). (1995)
T.Enoki:“低浓度的内皮素-1 在小鼠成纤维细胞和兔主动脉平滑肌细胞中持久激活阳离子电流”Br J Pharmacol。
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