オステオポンチン遺伝子導入トランスジェニックマウスの解析

骨桥蛋白基因转基因小鼠分析

基本信息

批准号：
07671987
负责人：
池田通
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07671987/
关键词：
オステオポンチントランスジェニックマウス遺伝子導入

项目摘要

【目的】骨基質蛋白のひとつであるosteopontinはその生理機能がまだ不明であるが、RGD配列を有することから、細胞接着機能を介して骨代謝に影響をおよぼしている可能性が考えられている。我々はin situ hybridizationにより、成熟骨組織では骨芽細胞ではなく、破骨細胞を含む骨吸収系の細胞でosteopontin遺伝子が発現していることを以前確認した。このことは、osteopontinが骨吸収に関与していることを示唆しているが、今回in vivoでのosteopontinの機能を明らかにする目的で、マウスosteopontinを過剰発現するトランスジェニックマウスを作製し、解析した。【方法】マウスosteopontinのcDNAをcytomegalovirus enhancer/chick β-actin promoterと融合させたtransgeneを、C57BL/6N x B6C3F1マウスの受精卵核内にmicroinjectionしてトランスジェニックマウスを作出した。これらのトランスジェニックマウスより得られたF1およびF2マウスを用いて、Northern hybridization, in situ hybridization, 抗osteopontin抗体を用いた免疫組織化学染色、tartrate resistant acid phosphatase (TRACP)活性染色、hematoxylin-eosin染色をおこなった。【結果】得られた15ラインのトランスジェニックマウスについてNorthern hybridizationをおこなったところ、11ラインはtransgeneの発現を認めたが、ライン間で発現レベルおよび発現臓器は異なっていた。また、骨組織を含む主要臓器で比較的高い発現を示した4ラインのF1マウスでは、発育遅延をきたした小型の個体が出現し、そのうちのひとつのラインでは、そのhomozygoteのF2マウスでほぼ全例に小型化を認めた。また、上記4ラインの骨組織の組織学的解析をおこなったところ、一次海綿骨梁およびTRACP陽性細胞の著明な減少が認められた。さらに抗osteopontin抗体を用いた免疫組織化学染色では、Northern hybridizationやin situ hybridizationの結果とは異なり、ほぼ骨組織特異的に蛋白が認められた。【考察】一次海綿骨梁が減少している原因として骨の形成不全または骨吸収の亢進が考えられるが、全身的な発育不全を伴っていたことおよび、TRACP陽性細胞が著明に減少していたことから、骨形成過程に異常があることが考えられた。トランスジェニックマウスにおいてTRACP細胞が著明に減少していた理由は不明であるが、現在各週齢のマウスを用いて骨組織の異常がいつ発現するかについて検討中であり、こらによりある程度原因が類推できるものと思われる。また、osteopontinのmRNAと蛋白の局在とに異なる部分が認められたことについては、詳細を明らかにすべく、現在Western blottingをおこなって比較検討中である。

目的：尽管其骨基质蛋白之一的骨桥蛋白的生理功能仍然未知，但由于它具有RGD序列，因此人们认为它可能会通过细胞粘附功能影响骨骼代谢。我们先前通过原位杂交证实，骨桥蛋白基因在包括破骨细胞的骨吸收细胞中成熟的骨组织中表达，而不是成骨细胞。这表明骨桥蛋白参与骨吸收，为了阐明骨桥蛋白在体内的功能，制备过表达小鼠骨桥蛋白的转基因小鼠并进行了分析。 [方法]将小鼠骨桥蛋白的cDNA与巨细胞病毒增强子/雏鸡β-肌动蛋白启动子融合，将其显微注射到C57BL/6N X B6C3F1小鼠的受精卵核中，以产生转基因小鼠。从这些转基因小鼠中获得的F1和F2小鼠使用抗固定桥蛋白蛋白抗体，防strate抗酸性磷酸酶（TRACP）活性染色和苏氧化物蛋白 - 性蛋白染色。 [结果]当在15条转基因小鼠上进行北部杂交时，11行显示了转基因的表达，但表达的表达水平和器官在两条线之间有所不同。此外，在四行F1小鼠中，在包括骨组织在内的主要器官中表现出相对较高的表达，出现了发育迟缓的小个子，并且在一条线上，几乎所有纯合F2小鼠都被观察到了微型化。此外，对上述四条线的骨组织的组织学分析显示，原发性的骨头小梁和TRACP阳性细胞显着降低。此外，与北部杂交和原位杂交的结果不同，使用抗op桥抗体的免疫组织化学染色几乎揭示了蛋白在骨组织中的蛋白质几乎特别是蛋白质。 [讨论]原发性推销骨小梁骨减少的原因被认为是由于骨骼发育不良或骨吸收增加引起的，但伴随着全身性发育不良，TRACP阳性细胞的显着降低，这表明骨形成过程中有异常。转基因小鼠中TRACP细胞显着降低的原因尚不清楚，但是我们目前正在研究何时在每个周大的小鼠中发生骨组织异常，并且看来可以在一定程度上推断出该原因。此外，为了阐明骨桥蛋白mRNA和蛋白质定位不同部分的细节，目前正在比较和考虑蛋白质印迹。