オステオポンチン遺伝子導入トランスジェニックマウスの解析

骨桥蛋白基因转基因小鼠分析

• 批准号: 07671987
• 负责人: 池田 通
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07671987/
• 关键词: オステオポンチン; トランスジェニックマウス; 遺伝子導入

【目的】骨基質蛋白のひとつであるosteopontinはその生理機能がまだ不明であるが、RGD配列を有することから、細胞接着機能を介して骨代謝に影響をおよぼしている可能性が考えられている。我々はin situ hybridizationにより、成熟骨組織では骨芽細胞ではなく、破骨細胞を含む骨吸収系の細胞でosteopontin遺伝子が発現していることを以前確認した。このことは、osteopontinが骨吸収に関与していることを示唆しているが、今回in vivoでのosteopontinの機能を明らかにする目的で、マウスosteopontinを過剰発現するトランスジェニックマウスを作製し、解析した。【方法】マウスosteopontinのcDNAをcytomegalovirus enhancer/chick β-actin promoterと融合させたtransgeneを、C57BL/6N x B6C3F1マウスの受精卵核内にmicroinjectionしてトランスジェニックマウスを作出した。これらのトランスジェニックマウスより得られたF1およびF2マウスを用いて、Northern hybridization, in situ hybridization, 抗osteopontin抗体を用いた免疫組織化学染色、tartrate resistant acid phosphatase (TRACP)活性染色、hematoxylin-eosin染色をおこなった。【結果】得られた15ラインのトランスジェニックマウスについてNorthern hybridizationをおこなったところ、11ラインはtransgeneの発現を認めたが、ライン間で発現レベルおよび発現臓器は異なっていた。また、骨組織を含む主要臓器で比較的高い発現を示した4ラインのF1マウスでは、発育遅延をきたした小型の個体が出現し、そのうちのひとつのラインでは、そのhomozygoteのF2マウスでほぼ全例に小型化を認めた。また、上記4ラインの骨組織の組織学的解析をおこなったところ、一次海綿骨梁およびTRACP陽性細胞の著明な減少が認められた。さらに抗osteopontin抗体を用いた免疫組織化学染色では、Northern hybridizationやin situ hybridizationの結果とは異なり、ほぼ骨組織特異的に蛋白が認められた。【考察】一次海綿骨梁が減少している原因として骨の形成不全または骨吸収の亢進が考えられるが、全身的な発育不全を伴っていたことおよび、TRACP陽性細胞が著明に減少していたことから、骨形成過程に異常があることが考えられた。トランスジェニックマウスにおいてTRACP細胞が著明に減少していた理由は不明であるが、現在各週齢のマウスを用いて骨組織の異常がいつ発現するかについて検討中であり、こらによりある程度原因が類推できるものと思われる。また、osteopontinのmRNAと蛋白の局在とに異なる部分が認められたことについては、詳細を明らかにすべく、現在Western blottingをおこなって比較検討中である。

【 objective 】 bone matrix protein の ひ と つ で あ る osteopontin は そ の physiology が ま だ unknown で あ る が, RGD match column を have す る こ と か ら, cells then functional を interface し て に affect bone metabolism を お よ ぼ し て い る possibility が exam え ら れ て い る. I 々 は the in situ hybridization に よ り, mature bone で は bone bud cells で は な く, contains osteoclasts を む bone absorption 収 cell の で osteopontin heritage 伝 son が 発 now し て い る こ と を confirmation before し た. こ の こ と は, osteopontin が bone absorption 収 に masato and し て い る こ と を in stopping し て い る が, now back to the in vivo で の osteopontin の function を Ming ら か に す る purpose で, マ ウ ス osteopontin を before turning 発 now す る ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス を cropping し, parse し た. 【 Method 】 ウスosteopontin cDNAをcytomegalovirus enhancer/chick β-actin promoterと fusion させたtransgeneを C57BL/6N x B6C3F1 マ ウ ス の fertilized egg inside nuclear に microinjection し て ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス を make し た. こ れ ら の ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス よ り have ら れ た F1 お よ び F2 マ ウ ス を with い て, Northern hybridization and in situ hybridization, Anti-osteopontin antibody を was stained by <s:1> た immunohistochemical staining, tartrate resistant acid phosphatase (TRACP) activity staining, and hematoxylin-eosin staining をお をお なった. 【 results 】 to ら れ た 15 ラ イ ン の ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に つ い て Northern hybridization を お こ な っ た と こ ろ, 11 ラ イ ン は transgene の 発 を now recognize め た が, ラ イ ン between で 発 now レ ベ ル お よ び 発 different showing viscera は な っ て い た. ま た を and bone tissue including main viscera で む quite high い 発 を now shown し た 4 ラ イ ン の F1 マ ウ ス で は, 発 遅 delay を き た し た small の individual が し, そ の う ち の ひ と つ の ラ イ ン で は, そ の homozygote の F2 マ ウ ス で ほ ぼ all cases に miniaturization を recognize め た. ま た, written 4 ラ イ ン の bone の histologic analysis を お こ な っ た と こ ろ, a spongy bone beam お よ び の zhao Ming な reduce が TRACP positive cells to recognize め ら れ た. さ ら に osteopontin antibody を resistance with い た immunohistochemical staining で は, Northern hybridization や the in situ hybridization の results と は different な り, ほ ぼ bone tissue specific protein に が recognize め ら れ た. [investigation] a spongy bone beam が reduce し て い る reason と し て bone の formation insufficiency ま た は bone absorption 収 の hyperthyroidism が exam え ら れ る が, systemic な 発 education is not complete を with っ て い た こ と お よ び, TRACP positive cells が zhao Ming に reduce し て い た こ と か ら and abnormal bone formation process に が あ る こ と が exam え ら れ た. ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に お い て TRACP cells が zhao Ming に reduce し て い た unknown reason は で あ る が, now each week 齢 の マ ウ ス を with い て abnormal bone tissue の が い つ 発 now す る か に つ い て 検 beg in で あ り, こ ら に よ り あ る degree reason が analogy で き る も の と think わ れ る. ま た, osteopontin の mRNA と protein の bureau in と に different な る part が recognize め ら れ た こ と に つ い て は, detailed を Ming ら か に す べ く now, Western blotting を お こ な っ て comparison 検 please で あ る.

项目成果

Yokose S,et al: "An estrogen deficiency caused by ovariectomy increases plasma levels of systemic factors that stimulate proliferation and differentiation of osteoblasts in rats." Endocrinology. 137. 469-478 (1996)

Yokose S 等人：“卵巢切除术引起的雌激素缺乏会增加刺激大鼠成骨细胞增殖和分化的全身因子的血浆水平。”

Ikeda T, et al.: "Cloning of rat type Ireceptor mRNA for BMP-2 and BMP-4 and comparison of the mRNA ocalization of its ligand." Dev. Dynamics. (in press).

Ikeda T 等人：“BMP-2 和 BMP-4 的大鼠型 I 受体 mRNA 的克隆及其配体的 mRNA 定位的比较。”

Ikeda T, et al.: "Changes in biological activity of bone cells in ovariectomized rats revealed by in situ hybridization" J. Bone Miner. Res. (in press).

Ikeda T 等人：“通过原位杂交揭示去势大鼠骨细胞生物活性的变化”J. Bone Miner。