CRISPR/Casを用いた事前増幅不要で高感度核酸検出可能な紙基板分析デバイス

使用 CRISPR/Cas 的纸基质分析装置无需事先扩增即可高灵敏度检测核酸

• 批准号: 22H02109
• 负责人: チッテリオ ダニエル
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02109/
• 关键词: CRISPR/Cas; 核酸分析; 比色分析; 分析デバイス; 高感度

これまで、紙を媒体とし、反応用酵素の固定化について試みたところ、非特異的な吸着または保持容量が低いことから、測定感度に大きく影響を与えることを予想した。そこで、よりフレキシブルにデバイスが作製できる3D印刷法を検討した。その特徴として、アクリル樹脂を基板とし、チューブに類似した溶液での反応系が実現可能であることから、保持容量による感度の低下を防ぐことが期待される。また、デバイスの形を柔軟にデザインすることができ、最もエンドユーザーに適する安価及び持ち運び可能なデバイスを設計することが実現できる。まず、プローブの設計を金ナノ粒子(AuNPs)―一本鎖DNAを(ssDNA)―アルカリフォスファターゼ(ALP)の複合体とした。溶液系において作製した複合体に基質の5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/Nitroblue Tetrazolium(BCIP/NBT)を加え、比色法を用いて合成したプローブのALP酵素活性を確認した。また、CRISPR/Cas複合体を用いてssDNAの切断実験を行い、バックグランドシグナルを抑えながら、ターゲットDNA濃度に応じたシグナル強度が確認できた。検出限界が1pMと低く、優れた結果が得られた。溶液系においてコンセプトを達成した後、3Dデバイスをデザインし、ポリマーを介してAuNPs-ssDNA-ALP複合体を3Dデバイスに固定化することを試みた。まず、ポリマーの合成に成功し、デバイスへのコーティング及び金ナノ粒子の固定化をX線分光装置(XPS)を用いて確認できた。また、ssDNA及びALP を標識し、基質を添加することによって、比色シグナルが観察された。最後に、CRISPR/Cas複合体を用いてssDNAの切断を検証し、ターゲットDNAの存在下で、ALPが溶液にリリースし、顕著な比色シグナルが観察された。

到目前为止，当尝试将酶固定为使用纸作为培养基的反应的酶进行反应时，我们预测，由于非特异性吸附或保留能力较低，它将对测量灵敏度产生重大影响。因此，我们研究了一种3D打印方法，该方法允许设备更灵活。该特征是，由于有可能使用丙烯酸树脂作为底物实现类似于管的溶液的反应系统，因此有望防止由于保留能力而降低灵敏度。此外，设备形状可以灵活设计，从而可以设计最适合最终用户的便宜和便携式设备。首先，该探针被设计为金纳米颗粒（AuNPS） - 链链DNA（ssDNA） - 碱性磷酸酶（ALP）的复合物。将底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/氮基四唑烷（BCIP/NBT）添加到在溶液系统中制备的复合物中，并确认了使用比色法的探针合成的ALP酶活性。此外，使用CRISPR/CAS配合物进行了ssDNA裂解实验，并在抑制背景信号时可以确认根据目标DNA浓度的信号强度。检测极限低至下午1点，从而产生了良好的结果。在解决方案系统中实现了概念后，我们设计了一个3D设备，并试图通过聚合物将AUNPS-SSDNA-ALP复合物固定到3D设备。首先，可以使用X射线光谱仪（XPS）确认聚合物成功合成的聚合物，并在设备上涂层并固定金纳米颗粒。另外，通过标记ssDNA和ALP并添加底物观察比色信号。最后，使用CRISPR/CAS复合物来验证ssDNA裂解，在存在靶DNA的情况下，ALP释放到溶液中，并观察到明显的比色信号。