CRISPR/Casを用いた事前増幅不要で高感度核酸検出可能な紙基板分析デバイス

使用 CRISPR/Cas 的纸基质分析装置无需事先扩增即可高灵敏度检测核酸

• 批准号: 22H02109
• 负责人: チッテリオ ダニエル
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02109/
• 关键词: CRISPR/Cas; 核酸分析; 比色分析; 分析デバイス; 高感度

これまで、紙を媒体とし、反応用酵素の固定化について試みたところ、非特異的な吸着または保持容量が低いことから、測定感度に大きく影響を与えることを予想した。そこで、よりフレキシブルにデバイスが作製できる3D印刷法を検討した。その特徴として、アクリル樹脂を基板とし、チューブに類似した溶液での反応系が実現可能であることから、保持容量による感度の低下を防ぐことが期待される。また、デバイスの形を柔軟にデザインすることができ、最もエンドユーザーに適する安価及び持ち運び可能なデバイスを設計することが実現できる。まず、プローブの設計を金ナノ粒子(AuNPs)―一本鎖DNAを(ssDNA)―アルカリフォスファターゼ(ALP)の複合体とした。溶液系において作製した複合体に基質の5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/Nitroblue Tetrazolium(BCIP/NBT)を加え、比色法を用いて合成したプローブのALP酵素活性を確認した。また、CRISPR/Cas複合体を用いてssDNAの切断実験を行い、バックグランドシグナルを抑えながら、ターゲットDNA濃度に応じたシグナル強度が確認できた。検出限界が1pMと低く、優れた結果が得られた。溶液系においてコンセプトを達成した後、3Dデバイスをデザインし、ポリマーを介してAuNPs-ssDNA-ALP複合体を3Dデバイスに固定化することを試みた。まず、ポリマーの合成に成功し、デバイスへのコーティング及び金ナノ粒子の固定化をX線分光装置(XPS)を用いて確認できた。また、ssDNA及びALP を標識し、基質を添加することによって、比色シグナルが観察された。最後に、CRISPR/Cas複合体を用いてssDNAの切断を検証し、ターゲットDNAの存在下で、ALPが溶液にリリースし、顕著な比色シグナルが観察された。

Immobilization of enzymes in paper, paper and reverse osmosis, non-specific sorption, low retention capacity, high sensitivity, etc. 3D printing method is discussed in detail. The characteristics of the resin substrate are similar to those of the solution. The reaction system can be realized, and the sensitivity can be reduced by maintaining the capacity. The shape of the device is flexible, and the device is safe and stable. AuNPs- 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/Nitroblue Tetrazolium(BCIP/NBT) was synthesized in a solution system and the ALP enzyme activity was confirmed by colorimetry. CRISPR/Cas complex is used to isolate ssDNA, to detect DNA concentration and to identify DNA intensity. The result of the test is 1pM and 1 pM. After the solution system was completed, the AuNP-ssDNA-ALP complex was immobilized in 3D. The successful synthesis of gold particles and the immobilization of gold particles were confirmed by X-ray spectroscopy (XPS). DNA, DNA and ALP are added to the matrix. Finally, CRISPR/Cas complexes were detected by PCR in the presence of ssDNA and ALP solutions.