CRISPR/Casを用いた事前増幅不要で高感度核酸検出可能な紙基板分析デバイス

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これまで、紙を媒体とし、反応用酵素の固定化について試みたところ、非特異的な吸着または保持容量が低いことから、測定感度に大きく影響を与えることを予想した。そこで、よりフレキシブルにデバイスが作製できる3D印刷法を検討した。その特徴として、アクリル樹脂を基板とし、チューブに類似した溶液での反応系が実現可能であることから、保持容量による感度の低下を防ぐことが期待される。また、デバイスの形を柔軟にデザインすることができ、最もエンドユーザーに適する安価及び持ち運び可能なデバイスを設計することが実現できる。まず、プローブの設計を金ナノ粒子(AuNPs)―一本鎖DNAを(ssDNA)―アルカリフォスファターゼ(ALP)の複合体とした。溶液系において作製した複合体に基質の5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/Nitroblue Tetrazolium(BCIP/NBT)を加え、比色法を用いて合成したプローブのALP酵素活性を確認した。また、CRISPR/Cas複合体を用いてssDNAの切断実験を行い、バックグランドシグナルを抑えながら、ターゲットDNA濃度に応じたシグナル強度が確認できた。検出限界が1pMと低く、優れた結果が得られた。溶液系においてコンセプトを達成した後、3Dデバイスをデザインし、ポリマーを介してAuNPs-ssDNA-ALP複合体を3Dデバイスに固定化することを試みた。まず、ポリマーの合成に成功し、デバイスへのコーティング及び金ナノ粒子の固定化をX線分光装置(XPS)を用いて確認できた。また、ssDNA及びALP を標識し、基質を添加することによって、比色シグナルが観察された。最後に、CRISPR/Cas複合体を用いてssDNAの切断を検証し、ターゲットDNAの存在下で、ALPが溶液にリリースし、顕著な比色シグナルが観察された。