中脳・小脳形成における組織間相互作用とIslet-3

中脑和小脑形成中的组织间相互作用和 Islet-3

• 批准号: 09275226
• 负责人: 岡本 仁
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09275226/
• 关键词: LIM; homeodomain蛋白; Islet-3; ゼブラフィッシュ; 小脳; 中脳; 神経分化; dominant negative; homeodomain

LIM/homeodomain型転写転写因子群は、zinc finger様の金属配位部位を持つLIM領域とDNA結合領域のhomeodomainを持つ蛋白の総称である。我々は、LIM/homeodomain蛋白群のうちのIslet-1,Islet-2がその特異的発現パターンから、ゼブラフィッシュ胚の運動神経の特異化と密接に関わっていることを見出した。我々の成果も含め最近のデータは、この遺伝子群が、中枢神経系の部域特異性や、個々の神経細胞の特異性を決定する際に重要な役割を果たすことを強く示唆している。試験管内での機能解析の結果、LIM domainは、通常homedomainのターゲットDNAへの結合を阻害しているが、特定の共役因子がこの部位に結合することにより阻害が解除され、homeodomainのターゲットDNAへの結合が可能となる、というモデルが提唱されている。我々はこのモデルに従い、眼と視蓋に特異的に発現するIslet-3のLIM領域のみをゼブラフィッシュ胚で過剰発現させ、共役因子を吸収することによって内因性Islet-3の機能を抑制する実験を行った。このような胚では、本来Islet-3を特異的に発現する眼と、本来Islet-3を特異的に発現する視蓋に隣接する中脳・後脳境界部の小脳原基のみが欠損するという著しく特異的な異常が観察された。この結果から、中脳視蓋部は中脳・後脳境界部の小脳原基に対して分化を誘導する作用を持っており、Islet-3が眼の分化のみならず、この誘導作用の発現をも制御していることが強く示唆された。我々は更に、逆にIslet-3の活性が人為的に上昇された場合の、中脳及び小脳原基の発達を調べるために以下の実験を行った。まず、LIM領域によるhomeo domainのDNA結合能の阻害を解除するために、LIM領域の金属配位部の構造がアミノ酸置換によって破壊されるように、Islet-3のcDNAに変異を導入した。更に、この変異Islet-3蛋白(Islet-3^<m3>)の活性を任意に制御するために、Islet-3^<m3>のC末端にglucocorticoid受容体のステロイド結合部位を結合させた組換え蛋白(Islet-3^<m3>-GR)をコードする組換え遺伝子を作製した。内因性のIslet-3は、共役因子との結合によって活性化すると考えられるが、Islet-3^<m3>-GRはglucocoidとの結合によって活性化することが期待された。Islet-3^<m3>-GRをコードするmRNAをin vitro転写によって作製し、1細胞期のゼブラフィッシュ受精卵に注入した。受精後12時間後の飼育液にデキサメサゾンを加えることによって、Islet-3^<m3>-GRを活性化させた。このような処理を受けた胚では、中脳・後脳境界領域の前後幅が、正常胚と較べて50〜100%拡大した。この結果は、Islet-3が中脳及と中脳・後脳境界部の間の相互的誘導作用のレベルを調整している可能性を更に支持している。現在このような個体で、中脳及び中脳・小脳境界部の発生に関わる因子群(Pax2,FGF-8,Engrailed,Wntlなど)の発現の変化の詳細を解析中である。

LIM/homeodomain type 転 writes 転 writes factor groups 転, zinc finger-like <s:1> metal coordination sites を hold <s:1> LIM domain とDNA binding domain <s:1> homeodomainを hold <s:1> protein 総 総 is called である. I 々 は, LIM/homeodomain protein group の う ち の itouch - 1, itouch - 2 が そ の specific 発 now パ タ ー ン か ら, ゼ ブ ラ フ ィ ッ シ ュ embryo の movement god 経 の, alienation と contact に masato わ っ て い る こ と を shows し た. I 々 も の results contain め recently の デ ー タ は, こ の heritage 伝 subgroup が, central 経 is の domain specificity や, god 々 の の 経 cells specificity を god decided す る interstate に important な "を cut fruit た す こ と を く and shown strong sucking し て い る. The で <s:1> function inside the test tube can analyze the <s:1> results and LIM Domain は, usually homedomain の タ ー ゲ ッ ト DNA へ の combining を resistance against し て い る が factor and specific の service が こ に の parts combine す る こ と に よ り resistance against が remove さ れ, homeodomain の タ ー ゲ ッ ト DNA へ の combining が may と な る, と い う モ デ ル が mention sing さ れ て い る. I 々 は こ の モ デ ル に 従 い, eye と cover に specific に 発 now す る itouch - 3 の LIM domain の み を ゼ ブ ラ フ ィ ッ シ ュ embryo で through turning 発 now さ せ factor, total service を suction 収 す る こ と に よ っ て endogenous itouch - 3 の function を inhibit す る be 験 を line っ た. こ の よ う な embryo で は, originally itouch - 3 を specific に 発 now す る と, originally itouch - 3 を specific に 発 now す る see cover に 隣 meet す る 脳 · の 脳 state department after small 脳 primordium の み が owe loss す る と い う the し く specific な abnormal が 観 examine さ れ た. こ の results か ら, 脳 eye lid は 脳 · の 脳 state department after small 脳 primordium に し seaborne を て differentiation inducing す る role を hold っ て お り, itouch - 3 が eye の differentiation の み な ら ず, こ の entrainment の 発 now を も suppression し て い る こ と が く and shown strong sucking さ れ た. I 々 は に, inverse に itouch - 3 の active が artificial に rise さ れ の た occasions, small 脳 and び 脳 primordium の 発 da を adjustable べ る た め に の below be 験 を line っ た. ま ず, LIM に よ る homeo domain の DNA binding energy の resistance against を remove す る た め に, LIM domain の metal complexing の tectonic が ア ミ ノ acid replacement に よ っ て broken 壊 さ れ る よ う に, itouch - 3 の cDNA に - different を import し た. More に, こ の - different itouch - 3 protein (itouch - 3 ^ < m3 >) の active を arbitrary に suppression す る た め に, itouch - 3 ^ < m3 > の C terminal に glucocorticoid by let body の ス テ ロ イ ド combining site を さ せ た group in え protein (itouch - 3 ^ < m3 > - GR) を コ ー Youdaoplaceholder0 sets え residues 伝 を to make ドする た. Endogenous の itouch - 3 は factor, total service と の combining に よ っ て activeness す る と exam え ら れ る が, itouch - 3 ^ < m3 > - GR は glucocoid と の combining に よ っ て activeness す る こ と が expect さ れ た. Itouch - 3 ^ < m3 > - GR を コ ー ド す る mRNA を in vitro planning write に よ っ て as し, phase 1 cell の ゼ ブ ラ フ ィ ッ シ ュ fertilized egg に injection し た. After 12 time after fertilization の rearing liquid に デ キ サ メ サ ゾ ン を plus え る こ と に よ っ て, itouch - 3 ^ < m3 > - GR を activeness さ せ た. こ の よ う な 処 Richard を by け た embryo で は, 脳 in の 脳 state after field before and after picture が and normal embryo と べ て 50 ~ 100% company し た. こ の results は, itouch - 3 が 脳 and と 脳 · 脳 after state department の の mutual induction between の レ ベ ル を adjustment し て い る possibility を に support し て い る. Now こ の よ う な individual で 脳, small, medium 脳 and び 脳 state department の 発 raw に masato わ る factor group (Pax2, FGF - 8, Engrailed, Wntl な ど) の 発 is の variations in の を detailed analytical で あ る.

项目成果

岡本仁: "脳の複雑化と多様化" 現代化学. 11月号. 53-59 (1997)

Hitoshi Okamoto：“大脑的复杂性和多样化”现代化学 11 月号（1997 年）。

Higashijima,S.,Okamoto,H.,Ueno,N.,Hotta,Y.,and Eguchi,G.: "High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using prooter of zebrafish origin." Developmental Biology. 192. 289-299 (1997)

Higashijima,S.、Okamoto,H.、Ueno,N.、Hotta,Y.和Eguchi,G.：“通过使用斑马鱼的启动子，高频生成在整个肌肉或整个身体中可靠表达 GFP 的转基因斑马鱼

Higashijima,S.,Nose,A.,Eguchi,G.,Hotta,Y.,and Okamoto,H.: "Mindin/F-spondin family : novel ECM proteins expressed in the zebrafish embryonic axis." Developmental Biology. 192. 211-227 (1997)

Higashijima,S.、Nose,A.、Eguchi,G.、Hotta,Y. 和 Okamoto,H.：“Mindin/F-spondin 家族：在斑马鱼胚胎轴中表达的新型 ECM 蛋白。”

岡本仁: "LIM/ホメオドメイン型転写因子群" Bio Science用語ライブラリー(脳神経), 164-165 (1997)

Hitoshi Okamoto：“LIM/同源域型转录因子”生物科学术语库（颅神经病学），164-165（1997）

Kikuchi,Y.,Segawa,H.,Tokumoto,M.,Tsubokawa,T.,Hotta,Y.,Uyemura,K.,and Okamoto,H.: "Ocular and cerebellar defects in zebrafish induced by overexpression of the LIM domain of the Islet-3 LIM/homeodomain protein." Neuron. 18. 369-382 (1997)

Kikuchi,Y.、Sekawa,H.、Tokumoto,M.、Tsubokawa,T.、Hotta,Y.、Uyemura,K. 和 Okamoto,H.：“LIM 结构域过度表达引起斑马鱼的眼部和小脑缺陷