リボザイムの生体内での機能発現

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1)ハマ-ヘッドリボザイムの活性部位の前後の配列は、切断部位に依存して変化し、これが活性部位の配列と塩基対合し、リボザイムの活性部位が破壊される場合がしばしば生ずる。即ち、一つのmRNAを標的とする場合、その中に存在する多くの可能な切断部位の中から、このような可能性がないものをあらかじめ選択し、それに対するリボザイムを用いることが必要条件の一つである。C.elegansにおける標的遺伝子として、その発現抑制の効果が見易いuncー22を選んだ。uncー22mRNAの多数のGUC配列をもつリボザイムの切断部位の中から、上記の基準により、切断を受ける可能性の高い3つの部位を選択した。これらの各々6+6、8+8または10+10塩基対合をし得るリボザイムを調製し、in vitroでuncー22mRNAの部分配列に対する切断活性を調べた。この結果37℃及び20℃において、いずれの場合も10+10または8+8塩基対合のリボザイムが最も高い活性を示した。2)これらのリボザイムをC.elegans生体内で発現させるプロモ-タ-としてuncー54遺伝子、熱誘導遺伝子hsp16ー1等のものを、lacZリポ-タ-を利用してテストしている。またリボザイム有効に機能させるため、その遺伝子を染色体に組み込んで安定化させる予定である。3)ラット脳海馬における学習・記憶の機構をリボザイムの導入により解明することを最終目的とし、培養細胞レベルでの予備実験のため、ラットHY1細胞の全RNA調製した。CaMキナ-ゼII、NGFIーA、Gs α mRNA等についてnorthern hybridizationを行ったところ、Gs α mRNAのみが明確に検出された。このGs α mRNAについて、前記の基準により、最も切断される可能性の高い2つの部位を選択し、それぞれに対する7+7塩基対合リボザイムを調製した。これらはともに、37℃において、切断部位を含む16ヌクレオチドの短い基質RNAを切断する強い活性を示した。4)Gs α及びNGFIーAに対するリボザイムの遺伝子をそれぞれグルココルチコイドによって誘導されるpMAMneoベクタ-に挿入した。これをHY1細胞に導入して形質転換クロ-ンを多数分離し、dexamethasoneで誘導後そのRNAを調製した。現在リボザイム及びmRNAのnorthern解析を行っている。