新しい遺伝子導入法を応用したヒト染色体の安定化に必要なDNA構造の研究

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昨年度は、ヒト人工染色体のクロ-ニングのためにpMYAC1、pMYAC2の2つのベクタ-を作成した。これらのベクタ-は直鎖状のDNAが培養動物細胞の核内で安定に存在するために必要であると考えられる一次構造のうち、ヒトのテロメア構造を持っている。また培養細胞を使って機能的にクロ-ニングするために、これらのベクタ-は動物細胞で働く選択マ-カ-としてハイグロマイシン耐性とブラストサイジン耐性を、またクロ-ニングしたDNAが出芽酵母で安定に人工染色体として存在できるようにTRP1・ATR・CEN4およびURA3遺伝子をそれぞれ含み、さらに制限酵素で切断して直鎖状にするとヒトのテロメア配列が末端にくるように工夫してある。今年度は、ヒト・リンパ腫由来で正常2倍体の染色体を持つGM0131細胞より分解を受けていない巨大DNAをアガロ-ス・ビ-ズ中で調製し、これを制限酵素EcoRIで部分加水分解したあとさらに低融点アガロ-ス中でパルスフィ-ルド電気泳動を行って精製し、約500KbpのDNA断片を得た。このDNA断片にNotIとEcoT22Iで切断したMYACベクタ-をつないだ後、もう一度パルスフィ-ルド電気泳動を行って結合していないベクタ-を除き、約500KbpのDNAを含むアガロ-ス片をLipofectin存在下で加水分解してマウスL細胞に導入した。この細胞をハイグロマイシン・ブラストサイジンの存在下で生育させ、2つの薬剤に同時に耐性を持つ約20個のコロニ-を得た。現在この細胞にヒトの塩基配列を含む約500Kbpの独立に複製するDNAが含まれているかどうかを解析中である。