脳由来の新神経細胞生存維持因子の単離

脑源性新神经细胞存活维持因子的分离

• 批准号: 07264244
• 负责人: 森 啓
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Tokyo Institute of Psychiatry
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07264244/
• 关键词: 神経変性死; 栄養因子; 培養

胎生18日齢のラット大脳皮質神経細胞の初代培養を用いた.細胞密度は24-well培養皿に低密度(0.8×105/cm2)で播種した.これに細胞播種と同時にウシ脳ホモジェネート調製液を加え,4日間培養後にMTTキットにて生存細胞を定量し,コントロールと比較した.ウシ脳ホモジェネートの調製はPBSにプロテアーゼ阻害剤を加えたものを用い,ブレンダーで懸濁し,10万g遠心上清を得た.この上清の30-50%硫安画分沈殿を50mMTris-HCl pH7.6に溶解し,脱塩後に50mMTris-HCl pH7.6で平衡化したDEAE sephacel に吸着させ,0-0.12M NaClの分画を抽出した.この抽出液を硫安で濃縮した後,ケ-ル濾過 Sephacryl S-100HR(φ2.5×100cm)にて分取したサンプルから分子量別に4つの生物活性ピーク(A,B,C,D)を得た.40K付近の peak A を集め,脱塩後に10mMリン酸バッファーにて平衡化したResouce Q に吸着させ,0-0.3M NaClの linea gradient にて抽出した.Resouce Qの0-0.3M NaCl linea gradient にて活性が3peakに分かれた.各フラクションの抗NSE抗体(Enzo Biochem)と抗CPB-1(=AnnexinV)抗体(Kowa)によるWestern blottingの結果,NSE(neuron specific enorase)やCPB-1による活性peak以外に 0.08-0.1M NaCl付近に新しい活性中心を発見した.硫安を加え1.2M硫安サンプルとし,疎水性カラムphenyl superoseに吸着させ,1.2-OM硫安の linear gradient で抽出し,ゲル濾過 superdex 75(φ10×300mm)を行った.新しい活性は phenyl superose にて0.7-0.5M硫安分画みられ,次の superdex 75 のゲル濾過にて約30K付近に来ることが判った.SDS-PAGEの銀染色にて候補の活性物質は約22Kと約29Kと考えられた.現在,ウシ脳約4KgのLarge scaleで精製し,蛋白の同定中である.

On the 18th day of the viviparous period, the primary culture of the large cortical nerve cells was carried out. The cell density was low density (0.8×10) in a 24-well culture dish. 5/cm2) Sowing of cells. At the same time, the seeding of cells is done with the preparation of the prepared solution, and after 4 days of culture, the MTT is added. Survival cell quantification, コントロールと comparison, ウシ脳ホモジPBS modulation system PBS system Use い, ブレンダーでsuspended し, 100,000 g of the telecentric supernatant to obtain 30-50% of the sulfuric acid supernatant and 50mM Tris-HCl pH7.6, dissolved, deionized, 50mMTris-HCl, pH7.6, balanced, DEAE sephacel, adsorbed, 0-0.12M After the NaCl is separated and extracted, the extracted solution is sulfuric acid and concentrated, and then filtered by Sephacryl. S-100HR (φ2.5 × 100cm), molecular weight, molecular weight, biological activity (A, B, C, D), 40K, peak Aを集め, 10mM リン acid バッファーにて balanced したResouce Q にsorbing させ, 0-0.3M NaCl linea gradient にてdraw out した.Resouce Qの0-0.3M NaCl linea gradient にてActivity が3peakに分かれた.each フラクションのanti-NSE antibody (Enzo Biochem) and anti-CPB-1 (=AnnexinV) antibody (Kowa) and Western blotting results, NSE (neuron specific enorase) and CPB-1 activity peak other than 0.08-0.1M NaCl pays close to the new active center of the active center. Sulfan chloride plus 1.2M sulfan chloride phenyl, water-based chlorphenyl Superose absorbs, linear gradient of 1.2-OM sulphur, extracts, filters, superdex 75 (φ10×300mm), new activity, phenyl superoseにて0.7-0.5M sulfur dioxide, みられ, times no superdex 75のゲルfiltered にてapproximately 30K paid close to にことがadjusted った. SDS-PAGE silver stained にてThe supplement active material is about 22K, about 29K, and the test is about 4Kg. Now, it is about 4Kg. Large The scale is refined and the protein is the same.

项目成果

Tamaoka, A. et al.: "Antibodies to amyloid β protein(Aβ) crossreact with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)" Neurobiol. of Aging. (印刷中). (1996)

Tamaoka, A. 等人：“β 淀粉样蛋白 (Aβ) 的抗体与 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 发生交叉反应”Neurobiol of Aging（1996 年出版）。

Tamaoka A et al: "Ubiquitinated αB-crystallin in glial cytoplasmic inclusions from the brain of a patient with multiple system atrophy." J Neurol Sci. 129. 192-198 (1995)

Tamaoka A 等人：“多系统萎缩患者大脑胶质细胞质内含物中的泛素化 αB-晶状体蛋白。”J Neurol Sci。129. 192-198 (1995)

Mori, H. et al.: "Tau in cerebrospinal fluids : Establishment of the sandwich ELISA with antibody specific to repeat-sequence in tau" 186. 181-183 (1995)

Mori, H. 等人：“脑脊液中的 Tau：使用对 tau 重复序列具有特异性的抗体建立夹心 ELISA”186. 181-183 (1995)

Tamaoka, A. et al.: "Amyloid β protein 1-42/43(Aβ1-42/43) in cerebellar diffuse plaques: enzyme-linked immunosorbent assay and immunocytochemical study" Brain Res.679. 151-156 (1995)

Tamaoka, A. 等人：“小脑弥漫性斑块中的淀粉样蛋白 β 蛋白 1-42/43(Aβ1-42/43)：酶联免疫吸附测定和免疫细胞化学研究”Brain Res.679 (1995)。

Gearing, M. et al.: "Regional variation in the distribution of apolipoprotein E and Aβ in Alzheimer's disease" J. Neuropathol. Exp. Neurol.54. 833-841 (1995)

Gearing, M. 等人：“阿尔茨海默病中载脂蛋白 E 和 Aβ 分布的区域变异”J. Neuropathol.54 (1995)。